基于网络药理学探析补中益气汤治疗变应性鼻炎的作用机制

戚媛媛 韩秀丽 王旗旗 杨祺 王玉明

摘要 目的：基于网络药理学探析补中益气汤治疗变应性鼻炎的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选得到补中益气汤的化学成分和作用靶点，同时利用GeneCards数据库获得与变应性鼻炎治疗相关的靶基因，利用Cytoscape3.7.1软件将所获得数据进行“药物-成分-疾病-靶点”网络可视化模型构建，使用STRING数据库构建共有靶基因的蛋白质-蛋白质相互作用（ PPI）网络，最后采用R软件以P<0.05、Q<0.05进行关键靶基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG） 功能富集分析。结果：筛选出补中益气汤有效活性成分172个，其治疗变应性鼻炎的机制可能与IL6、VEGFA、JUN、MMP9、MMP2等核心靶蛋白密切相关，推测其主要通过参与IL-17、TNF、HIF-1、Toll样受体、PI3K-AKT、核因子κB、MAPK、Th1和Th2细胞分化、JAK-STAT等信号通路干预调控变应性鼻炎。结论：本研究揭示了补中益气汤治疗变应性鼻炎多基因、多靶点、多通路的网络调节机制，从整体角度阐述了中医药有效的作用机制，为下一步实验研究提供分子层面的思路。

关键词 补中益气汤;变应性鼻炎;网络药理学;药物活性成分;靶点;网络可视化模型;蛋白质-蛋白质相互作用网络;通路富集分析

Abstract Objective：To study the mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of allergic rhinitis based on network pharmacology.Methods：The chemical components and targets of Buzhong Yiqi Decoction were screened according to the traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform（TCMSP） database platform.Meanwhile，gene card database was used to obtain the target genes related to the treatment of allergic rhinitis.The network visualization model of drugs，components，diseases and targets was built by using the software of Cytoscape 3.7.1.The PPI network of protein interaction of common target genes was constructed by using STRING database.Finally，the function enrichment analysis of key target genes GO and KEGG was carried out by using R software（P<0.05） Q<0.05 was for functional enrichment analysis of key target genes GO and KEGG.Results：A total of 172 active components of Buzhongyiqi Decoction were screened out.The mechanism of its treatment of allergic rhinitis may be closely related to IL6，VEGFA，JUN，MMP9，MMP2 and other core targets.It is speculated that it mainly participated in the regulation of allergic rhinitis through signal pathways such as IL-17，TNF，HIF-1，Toll like receptor，PI3K-AKT，NF-κB，MAPK，Th1 and Th2 cell differentiation，JAK-STAT etc.Conclusion：This study reveals the network regulation mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of allergic rhinitis，and explains the effective mechanism of TCM from a holistic perspective，and provide molecular thinking for the next step of experimental research.

Keywords Buzhong Yiqi Decoction; Allergic Rhinitis; Network Pharmacology; Pharmaceutical Active Ingredients; Target; Network Visualization Model; PPI Network; Pathway Enrichment Analysis

中图分类号：R276.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.005

变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）又称变态反应性鼻炎，是特应性个体接触变应原后导致的包含IgE介导的炎症介质的释放和多种免疫活性细胞、细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症性疾病。本病为耳鼻咽喉科常见疾病之一，据WHO公布数据，目前全世界有近6億变应性鼻炎患者，且随着国家工业化程度的提高而呈现出不断上升的趋势[1]。在美国2015变应性鼻炎临床指南中，强推荐的药物为鼻内糖皮质激素和第二代口服抗组胺药，但均存在以缓解症状为主而难以根治的局限性[2]。中医基于整体观和辨证论治的诊疗思路，采用中药复方治疗的手段，在临床上取得了显著的疗效。

补中益气汤出自金代李东垣《内外伤辨惑论》，具有健脾益气，升阳举陷之功效，其药物组成包括：黄芪、白术、陈皮、升麻、柴胡、人参、甘草、当归。肺、脾、肾亏虚是变应性鼻炎发病的重要内因，而其中脾虚这一证型发病率相对最高[3]。现代研究表明[4]，补中益气汤有调节脾、胃、肠功能，调节免疫功能、抗过敏及调节应激反应等作用，临床上广泛运用于AR治疗且疗效确切，强调其药理学研究有利于进一步充实完善中医理论，使其在指导AR治疗方面有据可循。

网络药理学是基于系统生物学的理论，通过对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科[5]。网络药理学强调对信号通路的多途径调节，可以从多途径、多成分、多靶点的角度阐明中药研究的基础理论，并结合分子功能、生物学过程分析，对分子层面的作用机制进行解释，为中药现代化研究提供了全新的思路。本研究拟通过网络药理学探析补中益气汤对AR的治疗作用及其作用机制，为补中益气汤对AR的治疗提供细胞分子层面的参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 药物成分及其作用靶点筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索补中益气汤中的药物，并结合文献收集药物的化学成分及靶点信息。口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和类药性（Drug Likeness，DL）是评价一个化合物是否可以发展成为一个药物的重要指标[6-7]。根据相关研究，本研究选取同时满足OB≥30%、DL≥0.18的化学成分作为候选活性成分，并使用Uniprot数据库，将靶点名称进行矫正统一。对白术、柴胡、陈皮、当归、甘草、黄芪、人参、升麻的有效成分进行筛选，结合文献[8-11]补充纳入白术中的白术内酯，柴胡中的柴胡皂苷A、柴胡皂苷D，陈皮中的橙皮苷，当归中的阿魏酸，甘草中的18β-甘草次酸。

1.2 AR作用靶点筛选 基于GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）包含治疗疾病相关的基因的信息与蛋白质靶标，使用GeneCards数据库以“Allergic Rhinitis”为关键词进行检索，获得AR相关的作用靶点。

1.3 药物-疾病共同靶点的筛选 于Venny2.1在线软件作图工具平台分别录入补中益气汤与AR的靶点，将二者比较取交集，并绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点。

1.4 网络可视化模型的构建及分析 利用Cytoscape3.7.1软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图，基于可视化模型相关网络特征值数据进行后续分析。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络 将所得药物-疾病共同靶点输入到STRING数据库（https：//string-db.org/）中进行检索，选取置信度（minimum required interaction score）>0.4，构建PPI网络，并根据蛋白之间的关联度进行排序。在Venny 2.1在线软件作图工具平台上输入233个药物靶点、1 404个疾病靶点，绘制韦恩图。将补中益气汤中172个潜在活性成分与109个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape软件中，删除与靶点无交集的成分，绘制出“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图。在STRING数据库中录入上述109个共同靶点，将物种（Organizm）设置为人类（Homosapiens），分析得到PPI网络。

1.6 通路富集分析 在R软件安装Bioconductor软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将药物-疾病共同靶点转换成entrezID。然后于R软件安装“ClusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05、Q<0.05进行关键靶基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）功能富集分析，以探索补中益气汤治疗AR的潜在生物学效益，并将结果以条形图的形式输出。

2 结果

2.1 补中益气汤活性成分及药物靶点 共得到有效活性成分172个，共筛选出233个药物靶点。

2.2 AR相关靶标获得 以“Allergic Rhinitis”为关键词在GeneCards数据库进行检索，获得AR相关靶点1 404个。

2.3 药物-疾病共同靶点获得 在Venny2.1在线软件作图工具平台上输入233个药物靶点、1 404个疾病靶点，绘制韦恩图，二者取交集后获得药物-疾病共同靶点109个。见图1。

2.4 药物-成分-靶点-疾病 将补中益气汤中172个潜在活性成分与109个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape软件中，删除與靶点无交集的成分，绘制出“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图。见图2。图2中紫色代表药物，蓝色代表补中益气汤中的133种活性成分（39个活性成分靶点与疾病靶点无交集，删除），绿色代表109个共同靶点，红色代表疾病。Degree值越大说明该成分在治疗AR中发挥越显著的作用，根据Degree值筛选出排名前10的活性成分，用于补中益气汤的潜在药效成分以进一步研究。见表1。

2.5 药物-疾病共同靶点PPI网络 在STRING数据库中录入上述109个共同靶点，将物种（Organizm）设置为人类（Homosapiens），分析得到蛋白相互作用的PPI网络。图3中每条边代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多代表关联度越大，则提示该靶点在AR治疗中越起到核心的作用，将得到PPI图中的靶点进行排序，筛选预测核心靶点，排名前30见图4。

2.6 GO和KEGG富集分析 将109个共同靶点经R语言运行后GO分析选取生物学过程。GO结果显示，交集基因集合共富集至2 111条生物学过程通路中，主要包括脂多糖反应、细菌源性分子反应、抗生素反应、氧化应激反应等。见图5。将109个共同靶点经R语言运行后共得到166条KEGG通路，前20的结果形成KEGG功能富集的条形图。P代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。结果显示共同靶点主要富集于IL-17、TNF、HIF-1、Toll样受体、PI3K-AKT、核因子κB、MAPK、Th1和Th2细胞分化、JAK-STAT等信号通路，提示核心靶点有可能由此参与调控AR进程。见图6。

3 讨论

变应性鼻炎属于中医学“鼻鼽”的范畴，多因于脏腑虚损、正气亏虚、卫表不固所致，其中脾胃虚弱、卫表不固是发病之关键。补中益气汤具有健脾益气、升阳举陷、甘温除热之良效，以其精妙独到的组方规律在临床广泛应用于消化系统及呼吸系统疾病。本方治疗鼻鼽通过重用黄芪、人参等补气温中之品，配伍以升提阳气、益气祛风的药物，从而达到和利阳气、宣通鼻窍、驱邪扶正的效果。另根据中医五行相生相克的理论，鼻为肺之窍，肺属金，脾胃属土，土为金之母。《石室秘录》云：“治肺之法，正治甚难，当转治以脾，脾气有养，则土自生金。”《难经》有云：“虚则补其母，实则泻其子。”基于鼻鼽脾胃虚损的病机和五行生克理论，补中益气汤以培土生金之法补肺健脾，使得肺气调和，则鼻窍通利。

本研究利用网络药理学手段，阐述补中益气汤治疗AR的分子作用机制，从微观角度解释中药复方作用机制。在药物活性成分筛选中，我们预测槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇等在治疗AR中可能发挥重要作用。槲皮素、异鼠李素以及柚皮素同属黄酮类化合物，具有调节免疫功能、抗肿瘤、抗氧化以及抗过敏等多种药理作用。Maatouk等[12]将柚皮素进行热处理后发现，小鼠T细胞的细胞毒作用得到抑制，而NK细胞杀伤活性显著提高。冯欣欣等[13]通过酸性非特异性酯酶染色法检测到，一定剂量的沙棘黄酮可以提高外周血ANAE阳性淋巴细胞数和D-半乳糖致衰老大鼠白细胞数，从而起到增强免疫的作用。此外，黄酮类化合物还能够通过增强巨噬细胞吞噬活性，阻碍抑制树突状细胞（Dendritic Cells，DC）活化途徑参与调控细胞免疫[14]。研究者利用大鼠进行AR造模发现，槲皮素可以有效改善AR大鼠鼻黏膜的炎症，其作用机制在于动态平衡变应性鼻炎Th1/Th2细胞因子比率，抑制肥大细胞组胺释放，拮抗IL-4、IL-5的一系列炎症趋化作用，从而减轻黏膜水肿和血管扩张[15]。在AR进程中，白三烯B4会引起炎症部位白细胞的聚集，增强炎症反应;肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以诱导血管内皮细胞表达黏附分子，从而促进炎症细胞的浸润与活化;前列腺素E2（PGE2）具有较强的血管扩张作用，能够通过提高血管通透性以增加其他炎症介质的致炎效应。实验发现，山柰酚可以同时抑制白三烯B4、TNF-α的释放;β-谷甾醇对IgE介导RBL-2H3细胞PGE2的释放具有较强抑制作用[16]。由此可见，这些活性化合物通过抑制血管通透性增加，干预炎症介质致炎效应等作用，发挥治疗AR的药效。AR的发病机制与遗传性相关的因素占33%～75%，因此，探索遗传基因与变应性鼻炎易感性之间的联系具有指导性意义[17]。我们通过PPI网络分析观察到，IL-6、VEGFA、JUN、MMP9、MMP2等可能是参与调控AR的核心靶蛋白。目前大量研究已证实，IL-6作为一种炎症介质，在参与变应性鼻炎的炎症反应中发挥了重要作用，能够促进T细胞的活化和增殖。在炎症反应发生和发展过程中，IL-6还能够激活炎症细胞，使其发生聚集并释放炎症介质;此外，IL-6的基因多态性也是多种免疫相关疾病的易感基因[18]。血管内皮生长因子A（VEGFA）是PDGF/VEGF生长因子家族的成员，VEGF与组织重塑和呼吸系统变应性炎症反应有着密切的联系。VEGF水平上升会使血管通透性升高，从而使血管外间隙渗入大量炎症介质、血浆蛋白与炎症细胞[19]，导致炎症反应加重。基于VEGFA的靶向组织重塑也成为了一种全新的治疗方向。相关文献报道，在AR患者鼻黏膜中，MMP-2、MMP-9的表达显著增加，其中MMP-9和肥大细胞之间具有强相关性，提示MMPs可能有助于炎症细胞如肥大细胞等向变应性鼻炎患者鼻黏膜的迁移，证实了在变应性鼻炎的形成中MMPs起到了积极的促进作用[20]。

通过KEGG富集分析显示，上述核心靶蛋白主要富集于IL-17、TNF、HIF-1、Toll样受体、PI3K-AKT、核因子κB、MAPK、Th1和Th2细胞分化、JAK-STAT等信号通路，提示复方活性成分很可能通过以上途径完成疾病进程的干预。白细胞介素-17（IL-17）是由Th17产生的细胞因子。研究指出，Th17参与宿主防御、自身免疫以及过敏反应急性期中性粒细胞浸润过程，具有强烈致炎效应;而IL-17则有助于诱导变应原特异性Th2细胞活化、嗜酸性粒细胞积累和血清IgE产生;由此可见，IL-17对Th2驱动的过敏免疫反应有调节作用[21]。Amin等[22]采用ECLIA实验发现，AR患者血清中的IL-17水平显著高于健康人群，并且能够促进人B细胞IgE的产生，提出高血清IL-17水平可能与鼻腔炎症有关，因此靶向IL-17（或增强对抑制性T细胞的调节）可能是一种治疗AR的有效方法。Toll样受体（TLRs）是一种天然免疫受体，主要在细胞膜或细胞质小泡中表达，这种天然免疫受体广泛识别具有相似特征的配体，即病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），随后可以参与识别多种病原体/变应原，也可以参与诱导免疫相关疾病[23]。TLR3、7、8是识别单链和双链RNA的最重要受体，通过不同的细胞内信号通路激活促炎转录因子，基于先天免疫反应在人类促炎性疾病中的关键作用，可以推测TLR3、7、8可能在过敏性鼻炎的诱导和进展中意义重大，它们有理由被认为是分子治疗的未来靶点[24-26]。HIF-1α是髓样细胞触发炎症的内源性必需物，在调节炎症反应中起到关键作用，它能够通过细胞自发的核因子κB活化促进上皮炎症，直接介导iNOS和VEGF的转录以诱导血管通透性增加和炎症反应。有研究发现，HIF-1α拮抗剂（YC-1）在变应性鼻炎和哮喘综合征（CARAS）的治疗中起到积极作用，它能够减少肺和鼻黏膜中OVA诱导的嗜酸性粒细胞浸润，抑制核因子κB和PPARα等多种炎症激活途径，证明HIF-1α与呼吸道变态反应的发病机制密切相关，提出HIF-1α通路可能是AR有希望的治疗靶点[27-28]。

本研究采用網络药理学的研究方式，通过多角度、多学科联合，整合了大量的生物学信息，巧妙运用网络预测模型具象化体现中药复方生物效用机制，为AR关键靶点、信号通路的后续实验研究带来全新展望。考虑到目前尚存在数据库不够全面，中药炮制过程中活性成分定位不够明确等局限性，复方药效物质基础的研究征途依然既艰苦、复杂又漫长，未来仍需进一步临床试验研究对预测结果进行验证。

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（2020-05-21收稿 责任编辑：张乐杰）