月季基因组SPL转录因子鉴定及表达特征分析

张宇鑫，李惠，张梦，宋翔，余游，余马，陈华

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2.绵阳市农畜产品质量安全检验检测中心，四川 绵阳 621000）

月季（Rosa chinensis）是世界上最受欢迎的观赏花之一，具有重要观赏价值和经济价值。花瓣的形状及颜色决定了月季的五彩斑斓，因而花瓣的发育对月季的美观起着重要作用。Squamosa promoter binding protein like（SPL）基因家族作为植物特有的转录因子，其家族成员能够与SQUAMOSA启动子结合，被称为SQUA启动子结合蛋白［1］。SPL基因编码一个高度保守的SBP结构域。该结构域约含76个氨基酸残基，包括Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-His两个串联锌指，并在C端具有核定位信号［2］。研究表明，SPL调控植物从营养生长到生殖生长的转化，调节叶片形态发生，参与环境信号的响应对植物生长发育发挥着重要作用［3］。此外，SPL基因参与调节花器官的形成及其后期发育［4］。

SPL基因最初从金鱼草的cDNA文库中分离出来［5］，随着植物基因组数据的不断发表，许多物种相继进行了SPL基因的全基因组鉴定与分析。拟南芥的基因组共鉴定出16个SPL基因［6］，随后SPL家族在番茄、苦荞、白桦树、绿藻、苔藓、玉米、葡萄、苹果、甜瓜、丹参、蓖麻、棉花、梅花、矮牵牛花、柑橘、小麦、菊花、辣椒等［7-24］中相继被分离鉴定出来，但目前月季的SPL基因尚未被鉴定。

本研究通过生物信息学的方法对月季RcSPL基因家族进行了全面分析，包括基因结构、染色体位置和共线性分析等，旨在探究RcSPL基因在月季花瓣发育中所行使的功能，为调控月季花瓣发育提供分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从已公布的转录组数据中挖掘月季转录组数据，月季转录组材料为花蕾期、开花期、凋谢期的近轴与远轴端月季花瓣。

1.2 方法

1.2.1 月季SPL基因序列的鉴定 月季的基因组序列和注释文件下载于月季Rosa chinensis‘Old Blush’基因组网站（https：//lipm-browsers.toulouse.inra.fr//pub/RchiOBHm-V2/）［25］。拟 南 芥 的16条SPL基 因下载于拟南芥数据库（https：//www.arabidopsis.org）。SPL基因家族的SBP-box结构域（PF03110）下载于Pfam（http：//pfam.xfam.org）数据库。16条拟南芥的SPL基因的蛋白序列被作为query序列进行比对，利用BLASTP（E＜10-5）在月季蛋白质数据库进行比对搜索，并除去重复序列。采用HMMER 3.0软件的隐马尔可夫模型（HMM）对SBP结构域［26］再次进行比对搜索，将2次搜索得到的序列取交集，最终确认为月季的RcSPL家族基因数目。

1.2.2 月季SPL基因家族分类及蛋白结构域、顺式作用元件分析 利用ClustalX 1.83将鉴定到的月季RcSPL家族蛋白序列和拟南芥SPL家族蛋白序列进行多重序列比对［27］，随后利用MEGA5采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树［28］，Bootstrap method设置为1 000。利用在线软件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）绘制基因结构图［29］。利用 在 线 软 件MEME 5.0.2（http：//meme-suite.org）［30］对SPL蛋白家族的保守基序进行预测，预测数目设置为10，其他参数为默认值。利用plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be）网站预测月季RcSPL基因上游2 000 bp的顺势作用元件。

1.2.3 染色体定位以及共线性分析 使用MapChart 2.2软件绘制月季RcSPL家族在染色体每条染色体的位置［31］。利用MCscanX软件分析月季RcSPL基因家族在基因组中的共线性以及复制事件［32］。

1.2.4 月季SPL基因的表达分析 根据已发表NCBI的SRA数据库中月季转录组数据（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject）提取出RcSPL基因的相关表达量，利用pheatmap软件包绘制相关热图［33］。

2 结果与分析

2.1 月季SPL基因家族成员鉴定、特征分析、进化树分析

通过blast和hmmer在月季的基因组中共检索出17个RcSPL基因，分别命名为RcSPL1至RcSPL17（表1）。系统发育树将拟南芥与月季的RcSPL基因分成8个亚组（图1），RcSPL6为Ⅰ组，RcSPL7、RcSPL8、RcSPL17为Ⅱ组，RcSPL1为Ⅲ组，RcSPL11、RcSPL14、RcSPL15为Ⅳ组，RcSPL2、RcSPL10为Ⅴ组，RcSPL3、RcSPL12、RcSPL13为Ⅵ组，RcSPL4、RcSPL9、RcSPL16为Ⅶ组，RcSPL5为Ⅷ组，Ⅳ组与Ⅶ组处于同一进化分支，Ⅲ组、Ⅷ组、Ⅴ组处于同一分支且亲缘关系更近。RcSPL基因蛋白序列长度为156～1 075 aa，分子量为17.7～118.62 kDa，等电点除RcSPL7均超过7，显弱碱性。

表1 月季SPL基因的起始位置、终止位置、相对分子质量、蛋白序列长度和等电点

图1 拟南芥和月季的SPL基因的系统发育树

2.2 月季SPL基因保守结构域、motif、基因结构、顺势作用元件分析

多序列比对分析结果表明，RcSPL基因中SBP结构域非常保守（图2），其包含两个锌指结构，Zn-1、Zn-2和一个高度保守的核定位信号。比较RcSPL基因外显子和内含子数量和位置（图3），RcSPL基因含有2～10个外显子，各亚组间成员所含外显子差异较大，Ⅱ亚组中含有最多的外显子，其中RcSPL7包含10个外显子，Ⅵ亚组成员所含外显子最少，均为2～3个；各亚组内成员间外显子数目相似。

图2 月季SPL蛋白序列关键部位的多序列比对结果

图3 月季SPL基因的基因结构

保守基序分析预测到10个保守基序（图4），将这10个保守基序按顺序命名为Motif 1～Motif 10，分析发现所有蛋白序列均含有Motif 1。Ⅱ亚组成员具有最多的保守基序，并且所含种类也最多，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ亚组成员均只含有Motif 1。

图4 月季SPL基因的进化关系和motif的预测

预测月季SPL基因上游2 000 bp的顺势作用元件（图5），定向分析了MYB与MYC的作用位点，发现其上游2 000 bp中含有2～13个MYB与MYC作用位点，除RcSPL2、RcSPL5均含有5个及以上的作用位点。

图5 月季SPL基因部分顺式作用元件分布情况

2.3 月季SPL基因的共线性分析、复制分析、染色体定位分析

染色体定位分析表明，RcSPL基因在除6号染色体外的其余6条染色体上均有分布（图6）。RcSPL的复制事件分析结果表明，该家族在月季中有两对串联复制基因，分别为1号染色体的RcSPL1和Rc-SPL2，2号染 色体的RcSPL7和RcSPL8。RcSPL1和RcSPL2分别为Ⅲ亚组和Ⅴ亚组，RcSPL7和RcSPL8均为Ⅱ亚组。共线性分析发现，月季中RcSPL基因有四个共线性块（图7）。

图6 月季SPL基因在染色体上的分布情况

图7 月季SPL基因的共线性分析

2.4 月季SPL基因家族表达分析

通过NCBI转录组数据分析发现月季花蕾期（FB）、开花期（OF）、凋花期（SF）花瓣的近轴（AD）与远轴（AB）RcSPL基因表达相关，大多数月季SPL基因的表达模式具有相似性，RcSPL3与RcSPL5显著正相关为0.9，且与其他基因具有相反的表达模式（图8）。基因表达分析表明月季的RcSPL基因在开花后期表达相对较高，RcSPL3、RcSPL5、RcSPL16在花蕾期表达相对较高，RcSPL1、RcSPL13、RcSPL9、RcSPL12在花凋谢时期表达相对较高，RcSPL2、Rc-SPL14、RcSPL4、RcSPL15在开花期和花蕾期表达相对较 高，RcSPL10、RcSPL11、RcSPL17、RcSPL6、Rc-SPL7、RcSPL8在花蕾期表达相对较高（图9）。

图8 月季SPL基因表达模式的相关性

图9 月季花瓣近轴与远轴RcSPL基因花蕾期、开花期、凋谢期的表达量

3 讨论与结论

SPL基因在植株的生长发育过程行使着重要的功能，研究在月季的基因组中共发掘出17个RcSPL成员，系统发育树分析将其分成8个亚组，每个亚组具有较为相似的基因结构且外显子数目基本相同，这与前人研究结果相符［34，35］。通过RcSPL蛋白序列的保守基序分析发现，每条RcSPL均具有Motif 1。此外，Ⅱ亚组具有最多的保守基序，最多的外显子，具有较高水平的表达，推测其在月季花开过程行使重要的功能。

RcSPL基因上游2 000 bp的顺式作用元件分析发现，该段区域具有2～13个MYB与MYC转录因子的作用位点，MYB是一种调控花色的转录因子，MYB与MYC在花青素的合成中起着重要的作用。有研究表明SPL基因与花青素的含量和花香有关［36］，因此推测SPL基因很可能与MYB和MYC相互作用调控月季花青素的含量，共同调控花的生长发育。

分析基因表达模式的相关性发现，大多数月季RcSPL基因的表达模式具有相似性，RcSPL3、RcSPL5的表达模式与其他基因相反，推测这两个基因可能发挥与其他RcSPL基因相反的功能。转录因子通常在控制组织特异性基因的表达中起着关键性作用［37］。根据RcSPL家族表达量的分析，发现RcSPL成员间表达差异明显。研究表明，拟南芥SPL8能够影响花粉的发育［38］，GbSBP6基因在银杏胚珠中显著表达且与拟南芥SPL8位于同一亚组，可能参与了银杏的花发育［39］，RcSPL1也位于该亚组，推测RcSPL1可能参与月季花粉形成的调控。前人研究表明拟南芥SPL3、SPL4、SPL5编码的转录因子能够调控开花时间和成花转变，该亚组的多数SPL成员与植物生殖器官的生长发育有关，野生葡萄的VvSBP11参与了 成 花 转 变 过 程［40］。RcSPL3与 拟 南 芥 的SPL3、SPL4、SPL5处于同一亚组且在花蕾期有相对的高表达，因此推测RcSPL3可能参与月季开花时间的调控。