非痰液样本结核分枝杆菌游离DNA检测在结核病诊断中的研究进展

李静 张燕 仵倩红

据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报道，全球范围内仍有近1/3的结核病患者未被诊断或报道，漏诊或漏报现象在儿童结核病、肺外结核和并发艾滋病患者中尤为明显[1]。儿童患者的呼吸道样本多为少菌型，许多HIV感染者也不能获取到检测结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)所需的标准呼吸道样本，均难以实现呼吸道样本的检测作用[2]，找到一种快速、低成本的非痰液诊断技术成为当前迫切所需[3]。抗酸杆菌涂片或分枝杆菌培养法一直是结核病诊断的“金标准”[4]，但对于非痰液样本(如血液、尿液等)，涂片法的阳性率更低，培养周期也过长，均难以满足临床检测的需求。而免疫学和分子生物学技术虽然在诊断敏感性和检测速度等方面较传统方法有了很大进展，但仍存在成本高、结果难以规范化、适用人群不广泛等诸多问题[5]。游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)的检测在这种情况下应运而生，因其具有无创取材、样本易留取等特点，逐渐受到国内外研究人员的重视，成为结核病非痰液样本检测研究的热点，弥补了特殊结核病患者诊断的局限性。

一、cfDNA的来源及应用现状

cfDNA是游离核酸的一种存在于生物体液中无细胞状态的胞外DNA片段，有着比DNA更低的相对分子质量，常以70～200 bp短片段或21 kb长片段的DNA-蛋白质复合物形式存在[6]，被普遍认为是细胞坏死和凋亡过程中释放出来的[7-10]。细胞坏死后，由巨噬细胞对细胞碎片进行消化，从而将DNA片段释放到血液中；或在细胞凋亡时，大多数细胞的形态学发生改变，细胞核固缩，DNA断裂并释放入血[11-12]。当前，cfDNA广泛应用于病原体检测、早期产前胎儿基因检测、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、肝癌或肝相关性寄生虫病等[13-17]，且诊断价值较高；而对于结核病领域，cfDNA的临床应用仍相对较新，目前尚不能直接应用于临床，但较多研究已在人体血液、胸腔积液、脑脊液及尿液等多种体液中检出cfDNA[18-21]，故认为cfDNA检测在结核病领域中具有广阔的应用前景。

二、影响血液和尿液样本中MTB-cfDNA检测前处理的因素

cfDNA是一种很有吸引力的检测和监测肺结核及肺外结核的生物标志物，但对肺结核和肺外结核患者的血液、胸腔积液、脑脊液和尿液等样本进行cfDNA检测的敏感度和特异度差异较大，分别介于29%～79%和67%～100%之间[18-21]，与WHO对新型结核病诊断优先目标产品的性能要求仍有一定差距。这可能与cfDNA半衰期短、稳定性较基因组DNA差、检测方法不一致有关，且这些研究均侧重于对其方法的对比，对样本分析前的影响因素涉及较少。

研究表明，在胎儿和肿瘤领域的cfDNA前处理方式不太适用于结核病领域的研究[22-25]，这使得开发适用于结核病检测的MTB-cfDNA前处理技术更具潜力。虽然美国Streck公司研发的BCT采血管可降低基因组DNA的释放，也可明显减少背景DNA的干扰，但其成本太高。2016年，Medina等[26]采用BCT采血管与乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)采血管进行对比采集血液，室温保存5 d，发现EDTA-K2采血管中cfDNA水平明显升高且稳定，但未分析其原因。2018年，Leng等[27]评估了cfDNA浓度及链完整性在非小细胞肺癌与结核病鉴别诊断中的潜在临床价值。所有受试者在采样前均未使用任何抗肿瘤或抗结核药物。分别采集受试者5 ml血液于含EDTA-K2的采血管中收集血浆，发现EDTA-K2可更好地保持cfDNA浓度及链完整性，且非小细胞肺癌患者的cfDNA浓度水平和链完整性明显高于结核病患者，提示EDTA-K2采血管可提高cfDNA的检测水平，且cfDNA释放量在癌性样本中更多，相较于传统肿瘤标志物[如CA125、血清神经元特异性烯醇酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)]，cfDNA链完整性对非小细胞肺癌和结核病的区分效果更高，认为cfDNA检测可作为鉴别结核病和非小细胞肺癌的指标。

2019年，Murugesan等[28]发表了对于影响血液和尿液中病原体cfDNA分析前变量的研究。该研究采集健康献血者的血液和尿液标本，并加入MTB-cfDNA制成人工样本；同时采集结核病患者的血液和尿液标本，通过研究两种方式在采血管和尿液的保存方式、处理延迟、样本量、是否冻融等方面的差异，评价影响检测cfDNA结果的因素。结果发现，与Streck采血管(含有EDTA-K2抗凝血剂和一种液态的细胞防腐剂)和静脉真空采血管(PAXgene)相比，加入MTB-cfDNA 的EDTA-K2血液采集管可以产生同等数量或更高水平的MTB-cfDNA；而在尿液中添加防腐剂也可有效防止MTB-cfDNA降解，但其效果要低于25 mmol/L的EDTA。在检测活动性结核病患者的血浆和尿液时，EDTA-K2 采集的血液和25 mmol/L EDTA保存的尿液中MTB-cfDNA的释放量要优于Streck采血管，且能在室温下稳定24 h。若在这24 h内单次低速离心血液样本则可明显增加MTB-cfDNA的释放量，但尿液样本的MTB-cfDNA释放量不受这一操作的影响。同时还发现，在人工样本和结核病患者样本中，体积量越大的血浆和尿液越可获得丰度更高的MTB-cfDNA；而在-80 ℃保存24周后的血浆和尿液样本中，其冷冻和解冻后MTB-cfDNA的丰度水平不受任何影响。故认为，将EDTA-K2采血管、单次低速离心及24 h延迟处理相结合可以产生更多的MTB-cfDNA，而且EDTA-K2管是实验室中最常见的采血管，其价格低廉，更适合推广使用。这几项处理前影响因素进一步优化和改进了MTB-cfDNA的获取方式，可为资源有限的广大研究者提供更好的选择和研究思路。但这些研究也有一定局限性，具体如下：(1)研究中结核病患者样本与人工样本的结果非常相似，但并非所有人工样本的结果都能得到证实。(2)研究的组别间可能存在重叠，可能造成统计误差，临床意义还需进一步研究。(3)比较血清或血浆中的MTB-cfDNA时，没有纳入血清采集管、肝素抗凝管，避免因抗凝剂不同而对收集效果产生不同影响。(4)未对超过24 h的前处理进行研究。

三、血液及尿液中MTB-cfDNA的提取

cfDNA有着比DNA更低的相对分子质量，血浆cfDNA主要是核小体，峰值长度为160～167 bp；而尿液cfDNA的峰值长度是由肾小球滤过功能决定的。这就要求所有尿液cfDNA片段需进一步迅速降解[29-32]，使得大部分碎片要低于100 bp，甚至低至30～60 bp[31,33-34]。对cfDNA片段大小的分析是评价cfDNA提取试剂盒的关键，而样本中cfDNA能否表现出高度片段化则是cfDNA提取的关键。当前，市面上研发出较多提取cfDNA不同片段的产品，然而不同的提取方法对cfDNA的回收率也不同。主要的提取方法有：基于硅膜的旋转柱技术、基于磁珠的分级筛选法和相分离法[35-36]，而前者是cfDNA提取量最大最纯的一种方法，以德国Qiagen公司的QIAamp游离核酸提取试剂盒应用最广泛。

2015年，Mauger等[37]比较了从不同血浆样品中分离cfDNA的11种提取方法，发现QIAamp和Norgen游离核酸提取试剂盒的准确性和重复性均最好，QIAamp游离核酸提取试剂盒的回收率最高，但因QIAamp试剂盒在cfDNA提取方面具有较大垄断性，导致经济成本较高。2018年，我国潘杰等[38]使用国产柱式cfDNA提取试剂盒对血浆cfDNA 提取效率、片段分布(102、268、402 bp)及不同片段DNA的回收率等方面进行了研究，发现使用国产试剂提取的cfDNA在102、268和402 bp处的条带强度均明显高于德国Qiagen公司相关产品，提示在提取效率上国产试剂可能优于Qiagen产品，国产柱式在各项评价性能上均可与Qiagen 产品媲美。但这两项研究只表明了这些产品在大于100 bp片段中的效果，对于低于100 bp的效果和是否适用于其他样本并未进行研究和说明。

2021年，Vogt等[39]在南非纳入9例淋巴瘤并发HIV感染患者和8例结核病并发HIV感染患者，收集全血样本于细胞专用管中，评估血浆cfDNA的数量和质量，通过下一代测序技术(next-generation sequencing，NGS)评估cfDNA的鉴别诊断能力。研究为获取高质量的cfDNA，采用了高敏感度的电泳法来评价cfDNA丰度，将测量90～400 bp内具有特征谱的片段指定为cfDNA，将>500 bp的片段指定为基因组DNA。结果显示，cfDNA的片段长度是一个限制因素，在400～500 bp间未能检测到DNA，在200～250 bp间血浆cfDNA的丰度最高，而<100 bp和>250 bp的片段均很少。淋巴瘤患者的显性cfDNA分子长度为130(95%CI：119.0～136.0)bp，与结核病患者的长度[139.5(95%CI：119.0～184.0)bp]接近；而继发性患者cfDNA分子的中位测量值为236(95%CI：205.0～287.0)bp，低于结核病患者[252.0(95%CI：222.0～335.0)bp]。定量结果显示，cfDNA在淋巴瘤患者中最为丰富，在淋巴瘤患者中cfDNA占所有分离DNA的91%(95%CI：89%～96%)，高于结核病患者的86%(95%CI：74%～93%)。这项研究结果为进一步研究结核病患者血液样本中cfDNA片段长度的选择提供了有力的依据，在此基础上选择适当的样本管直接采集并运输血液样本至实验室，有利于分离出高质量的cfDNA，可避免低质量cfDNA产生假阴性结果，但由于此研究样本量太小，限制了对NGS技术临床检测效能的评估，但仍可为研究人员提供一个新的研究思路。

这里特别要提到Oreskovic等[40]于2019年发表的尿液中小片段cfDNA提取方法的分析研究。这项研究从对片段长度的依赖性、低浓度萃取实验、不同条件下尿液的耐受性和对PCR抑制的敏感性几个方面比较了2种已发表的方案(Wizard/GuSCN和QSepharose)、3种商业核酸提取试剂盒(Norgen、QIAamp和MagMAX)和1种特异性内部序列杂交捕获技术的性能分析。研究内容如下：(1)选取长度为25、40、80 bp或150 bp的合成DNA靶蛋白，评估尿液cfDNA提取方法对片段长度的依赖性。结果显示，每一种提取方法在不同片段长度上的回收率均有所不同。杂交捕获是惟一能在25～150 bp所有片段长度上保持高回收率(73%～84%)的方法，QSepharose方案对40～150 bp片段也有类似的高回收率(63%～75%)，但对最短的25 bp片段的回收率较低(9%)。Wizard/GuSCN方案依赖于尿液成分，特别是pH值和DNA浓度，即使在调整尿液到最佳条件下，其回收率仍然很低(9%～17%)。Norgen试剂盒对40～150 bp片段的回收率为30%～41%，对25 bp片段的回收率为72%，说明此种方法更适合于片段较低的尿液样本。QIAamp试剂盒对150 bp片段的回收率约为18%，且对较短的40 bp和80 bp片段的回收率更低，分别为0.2%和1%，说明这个广受推荐的商业试剂盒更适用于血浆而不是碎片较多的尿液。MagMAX试剂盒对150 bp片段的回收率较高(66%)，但随着片段长度的减少回收率也很快降低，对40 bp片段的回收率几乎不存在(0.2%)。(2)低浓度萃取实验：在低浓度样本中，杂交捕获和三甲胺基烷基季铵基团琼脂糖凝胶电泳法可快速检测出所有阳性样本，而QIAamp和MagMAX试剂盒检测不出任何阳性样本。(3)不同条件下(pH值、背景DNA浓度和无机盐的变化)，Wizard/GuSCN方案的回收率高度依赖尿液条件，特别是pH值和背景DNA浓度，而无机盐的变化对回收率没有影响；表现为pH值高于6会降低回收率，背景DNA浓度增加会提高回收率，但最大回收率仍远低于其他方法，认为与其他方法能很好地耐受pH值、背景DNA浓度和无机盐的变化有关。(4)PCR抑制敏感性。杂交捕获、Wizard/GuSCN、QSepharose和QIAamp检测对高达40%的洗脱液均具有抗性，但Wizard/GuSCN和QSepharose 两种方法的洗脱液随浓度增加，抗性会减弱。MagMAX在20%洗脱液中受轻度抑制，在40%洗脱液中受严重抑制。Norgen在所有测试条件下均产生抑制，在40%洗脱液下无扩增。总之，杂交捕获和QSepharose效果最好，表现为对25 bp和40 bp短片段回收率高，对浓度检测敏感度高、对不同尿液有一定耐受能力，对PCR抑制有抗性。基于此，两者已被推荐用于尿液cfDNA的提取，但二者在临床样本中的检测效果仍未明确，期望早日获得理想效果。

四、cfDNA的检测方法

随着现代技术的不断应用，现已开发出多种cfDNA检测技术，这些方法可在2 d内报告结果，可快速高效地进行临床诊断，目前主要集中为以下两种：一种是靶向DNA测序技术，如实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)、数字PCR(digital PCR，dPCR)、微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和巢式PCR等[41-43]；一种是非靶向第二代测序技术，如全外显子测序和全基因组测序[44]，其中以MTB-cfDNA qPCR在结核病领域中应用最广，已成为结核病检测的常规方法。

1.血液样本cfDNA检测：2017年，Click等[45]纳入痰涂片均为阳性且均无分枝杆菌菌血症的32例HIV感染者和18例非HIV感染者，应用MTB-cfDNA qPCR技术从40例结核病患者血浆中检测出18例(45%)阳性，而GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)检测30份血浆，无一例阳性，表明MTB-cfDNA qPCR检测血浆诊断结核病具有可行性，为免疫功能低下的患者创造了新的检测起点。同年，Yang等[46]通过dPCR技术也检测到肺结核和肺外结核患者血液中的cfDNA，表明MTB-cfDNA dPCR检测对肺外结核的诊断也有潜在价值。2018年，Yamamoto等[47]应用dPCR检测1例血行播散性结核病患者中cfDNA的来源，这位患者痰液、血液、尿液标本经抗酸染色及qPCR均未检测到MTB，而此次利用dPCR则从血液标本中检测出MTB-cfDNA，且扩增阳性，与最终诊断相符合，这为肺结核和肺外结核的诊断提供了一种新型且侵袭性小的检测工具。2021年，Pan等[48]纳入了24例肺结核患者和57例结核分枝杆菌潜伏感染者(LTBI者)作为研究组和对照组，采用qPCR和ddPCR对血浆样本进行检测，评估cfDNA对诊断肺结核的敏感度和特异度，发现54.2%的肺结核患者可被检测到MTB-cfDNA，且MTB-cfDNA阳性与γ-干扰素(IFN-γ)反应水平相关，经过抗结核治疗后的患者MTB-cfDNA水平明显下降，表明治疗后的结核病患者MTB-cfDNA的释放量减少。该研究首次在LTBI者血浆标本中检测出cfDNA，提示血浆MTB-cfDNA是一种检测和监测结核感染与免疫相关的微生物学指标，但该研究样本量较小，仍需要大规模队列研究来评估血浆cfDNA检测在有结核病接触史和LTBI者治疗监测中的价值。

2.尿液样本cfDNA检测：近两年，由于尿液样本易收集、无创性留取的特点，以尿液为基础的各种诊断方法也成为研究的热点，尿液MTB-cfDNA则成为一种很有前途的结核病生物标志物，而据此检测肺结核和肺外结核患者的敏感度和特异度分别为43%～79%和89%～100%[47]。2021年，MacLean和Nathavitharana[49]回顾性研究了南非和美国地区的活动性肺结核患者的73份冷冻尿液样本。结果显示，MTB-cfDNA qPCR检测的敏感度为83.7%(95%CI：71.0%～91.5%)，特异度为100.0%(95%CI：86.2%～100.0%)，符合WHO公布的性能标准；而对未感染HIV的人群和涂片阴性的结核病患者检测的敏感度分别为73.3%(95%CI：48.1%～89.1%)和76%(95%CI：56.5%～88.5%)。研究也指出，获取尿液MTB-cfDNA 是一个高度复杂的过程，需要专门的试剂、实验室设备和训练有素的技术人员来完成样品制备，如果能在检验前获取一份高质量的尿液样本，MTB-cfDNA将会成为一个很好的生物标志物。

3.其他非痰液样本cfDNA检测：由于儿童结核病、肺外结核和艾滋病并发肺结核患者不具有特异性的临床表现，也缺乏敏感的诊断工具，临床诊断充满挑战。在MTB样本留取过程中，除方便采集的血液和尿液样本外，其他非痰液样本中检测MTB-cfDNA的价值也逐步得到研究。Che等[50]首次在结核病患者的胸腔积液中检测出MTB-cfDNA，并将培养法、Xpert法和MTB-cfDNA qPCR检测进行比对分析，三者检测的敏感度分别为27.1%(95%CI：19.2%～34.9%)、38.5%(95%CI：29.9%～47.2%)和79.5%(95%CI：72.4%～86.7%)。寿娟等[51]检测结核性胸膜炎患者胸腔积液中的MTB，发现MTB-cfDNA qPCR法的检测敏感度(63.11%)明显高于涂片法(11.65%)，说明qPCR技术检测结核病患者胸腔积液中的cfDNA，是一种快速准确的诊断方法。Li等[52]也采用涂片法、培养法、Xpert法和MTB-cfDNA qPCR多种方法检测结核性脑膜炎患者的脑脊液样本，发现他们的检测敏感度分别为2.2%、13.0%、23.9%和56.5%。Sharma等[53]首次在结核病患者腹腔积液样本中检测出MTB-cfDNA，并参照综合参考标准(CRS)对qPCR与Xpert法诊断腹部结核的准确性进行评价，发现qPCR对确定和可能的腹部结核的诊断敏感度为66.7%(95%CI：40.9%～86.7%)，特异度为97.1%(95%CI：84.7%～99.9%)；而对特异度相近患者的检测敏感度可提高到70.9%(95%CI：51.9%～85.8%)，而Xpert检测的敏感度仅为16.7%，但特异度为100.0%(95%CI：89.7%～100.0%)。这些研究均显示，MTB-cfDNA qPCR检测结核病的敏感度远高于其他方法，且阳性检出率明显提高，是一种准确的分子检测方法，可为MTB的病原学检测提供直接证据。

2021年6月发表了一篇应用MTB-cfDNA诊断结核病有效性的系统回顾性荟萃分析[54]，该分析包括了15项在结核病流行地区进行的研究，其中13项在中国、1项在印度、1项在南非；主要使用血液、尿液、脑脊液、胸腔积液和腹腔积液等非痰液样本；共纳入18篇文章，其中14篇是cfDNA与综合参考标准(CRS)比较的独立研究，4篇是与MTB培养法比较的独立研究。相较于综合参考标准和培养法结果，MTB-cfDNA检测的敏感度、特异度、曲线下面积(AUC)分别为68%、98%、0.97和48%、91%、0.88，各研究间虽异质性明显，但这些结果均表明cfDNA检测对诊断结核病的准确性明显优于综合参考标准和培养法，对肺结核和肺外结核具有良好的诊断性能，且可用于结核病的早期快速诊断。但这些研究的主要对象为成年人，仍缺乏儿童患者相关数据。另外，该研究结果显示，检测结核性胸膜炎中cfDNA的诊断价值最高，其次是结核性脑膜炎和腹部结核，虽然这几项研究样本量均较少，但不可否认，cfDNA检测有望成为少菌型结核病的有效诊断方法，为临床诊断结核病提供强有力的辅助支撑。

五、总结与展望

结核病仍然是全球卫生问题的一个重大挑战，虽然痰液和灌洗液是诊断结核病的传统样本，但难以用于儿童结核病、肺外结核、艾滋病并发肺结核和无痰/少痰者，且肺泡灌洗液取材具有侵入性，患者耐受性差。而MTB-cfDNA qPCR检测技术是以非痰液样本为检测基础，具有广泛的应用前景。尽管目前还没有该技术标准化的共识或指南，也在结核病研究领域中处于起步阶段，但近两年已在血液和尿液样本的前处理及提取方面取得了很大突破，可通过PCR技术检测结核病患者的血液、尿液等非痰液标本中的cfDNA，并获得较高的敏感度。然而，作为一种新型的分子标志物检测仍存在一些亟待解决的问题，一是提取早期患者的cfDNA难度较高，稳定性较差，需消耗大量的精力和物力，且缺乏对提取物标准化和科学的质量控制，尚不能指导临床应用。但不可否认，在具备合适的前处理、提取方法和检测方法的基础上，cfDNA检测仍具有巨大的研究潜力。二是cfDNA检测可能在有结核病治疗史的患者中特异度较低，其良好生物学特性可能仅适用于活动性结核病患者和LTBI者，相信在进一步的研究中一定能开启结核病快速诊断的新篇章。