肠道微生态与肝硬化自发性腹膜炎的关系研究

张建文，刘江凯，张小瑞

【提要】 自发性细菌性腹膜炎(SBP)是肝硬化严重并发症之一，具有高发病率、高复发率、高死亡率的特点，细菌易位是肝硬化SBP发病的重要机制。本文查阅了近年来相关文献，阐述了肠道菌群紊乱、胆汁酸代谢失调、肠屏障功能受损、免疫功能障碍、炎症反应等在SBP发病中的内在关系，总结了微生态制剂及粪菌移植防治SBP的作用机制，为临床通过从肠论治SBP及相关热点靶标研究提供一定的理论基础。

肠道微生物群是人体最庞大、最复杂的微生物群，肠道微生物与宿主之间相互协同、相互作用共同构成动态平衡的肠道微生态系统。肠道微生态失衡可导致多种肠内或肠外疾病，如炎症性肠病、代谢相关疾病等[1]。近年来随着高通量基因测序及宏基因组学等生物技术的发展，对肠道微生态的研究不断深入，发现肠道微生态的失衡与肝脏相关疾病尤其是终末期肝病如自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis, SBP)、肝性脑病(hepatic encephalopathy, HE)等的发生发展关系密切。SBP是肝硬化腹水在无明确腹腔内感染源的情况下发生的腹膜炎。据报道肝硬化腹水患者SBP发生率为10%～25%[2]，有SBP病史的肝硬化患者首次发作后的年复发率高达40%，死亡率高达55%[3-4]。SBP的发病机制虽未完全阐明，但大量研究证实其与肠道的细菌易位(bacterial translocation, BT)密切相关。一项回顾性研究[5]发现SBP患者腹水微生物主要是肠道细菌，尤以革兰阴性菌为主，如大肠埃希菌、克雷伯杆菌、肠杆菌、鲍曼不动杆菌等，近年来革兰阳性菌如链球菌、金黄色葡萄球菌引起的SBP也逐渐增多。此外，SBP患者的血液和腹水中检测到的细菌DNA与肠道细菌DNA相同，说明肠道是腹水细菌的来源，BT是肠道细菌进入腹水过程中的关键[6]。而肠道菌群紊乱、小肠细菌过度生长、胆汁酸代谢失调、肠道屏障功能受损等促进BT，引起肠道微生态失衡，诱发炎症级联反应及内毒素血症，加重肝脏损害，参与SBP病程。

1 肠道菌群紊乱

肠道是微生物群落最主要的栖息地，其细菌种类超过1 000多种，数量多达1014，是人类体细胞的10倍以上[7]。正常肠道中的优势菌群以厌氧菌居多，占肠道微生物的90%以上，主要是拟杆菌、双歧杆菌、消化球菌和梭菌等，能促进人体对食物的消化吸收，为人体提供必须的营养物质并能有效防御病原体的入侵。而大肠杆菌、韦荣球菌、肠球菌、变形杆菌和克雷伯杆菌等在一定条件下发生增殖失控转移到非肠道组织中则会对人体产生危害而成为致病菌。研究[8]发现SBP患者的肠道菌群在结构多样性和物种丰富度上均较正常人明显降低，属于变形菌门的肠杆菌科、盐单胞菌科，放线菌门的诺卡氏菌科及厚壁菌门的链球菌科和韦荣球菌科均明显增加，而属于拟杆菌门的拟杆菌科、普雷沃氏菌科及毛螺菌科明显减少。粪菌定量PCR显示肝硬化患者肠道内的有益菌种如乳酸菌、双歧杆菌、梭菌及细菌总量下降，致病菌如大肠杆菌、肠球菌明显增加，且致病菌的增加与SBP发生率、肝硬化严重程度、Child分级、MELD评分呈正相关[9]。表明肝硬化时肠道菌群紊乱，微生态失衡，促进BT，进而导致SBP的发生。

2 小肠细菌过度生长

小肠细菌过度生长(small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)指肠道中微生物群密度增加和/或组成异常。胃酸不足、肠道运动功能障碍等多种因素可引起SIBO，导致肠道微生态失衡，细菌发生易位，进一步促进炎症介质释放。质子泵抑制剂(PPI)可减轻肝硬化患者的消化道症状，但同时也增加了患SBP的风险。Elzouki等[10]研究发现使用PPI的肝硬化患者更易发生SBP(32.8%vs6.9%)。不仅如此，长期使用PPI也可增加SBP患者的死亡风险，如Hung[11]发现肝硬化SBP患者服用PPI组较未服用PPI组90 d和1年的死亡率(PPI组：49.0%、73.7%；非PPI组：43.8%、67.2%)明显增加，其机制可能是PPI的使用导致胃酸不能有效杀灭或抑制胃肠道内的细菌，引起SIBO。

肝硬化患者由于门脉高压，胃肠道长期的淤血缺氧，导致肠道动力不足，肠道运动功能出现障碍。Gundling[12]研究发现肝硬化患者小肠的移行性复合运动(MMC)平均持续时间较正常人明显延长(137 minvs87 min)，且与肝硬化严重程度密切相关，Child-C级患者MMC平均持续时间较B、A级患者明显延长(154.2 min、118.5 min、93.3 min)。在Maslennikov[13]对21项研究进行的荟萃分析中也发现肝硬化组SIBO患病率明显高于对照组(40.8%vs10.7%)，且失代偿期肝硬化患病率更高。而合并SIBO的肝硬化患者比无SIBO的肝硬化患者更易发生SBP。因此，肠动力不足，肠道运动功能障碍，管腔清除率不足引起的SIBO是SBP发生发展的重要因素之一。

3 胆汁酸代谢失调

胆汁酸(bile acids，BAs)对于脂质的消化、吸收及肝脏疾病的发生发展具有重要的意义。BAs的生成和代谢与肠道菌群密切相关。胆固醇在肝脏中被7α-羟化酶催化形成胆酸、鹅脱氧胆酸等初级胆汁酸，再与甘氨酸或牛磺酸作用形成结合型胆汁酸储存于胆囊中，进食后经胆囊分泌到肠道中，随后被肠道菌群分泌的胆盐水解酶(bile salt hydrolase, BSH)转化为游离型胆汁酸。大部分的胆汁酸在回肠末端重吸收进入门静脉系统，被肝脏摄取利用，完成肠肝循环[14]。肠道菌群中乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、李斯特菌以及某些梭菌、拟杆菌都可以产生BSH进而影响胆汁酸的代谢[15]，而胆汁酸则通过肝脏或肠道中的法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)及G蛋白偶联受体5(G protein-coupled receptor 5, TGR5)影响肠道菌群结构。胆汁酸具有直接杀菌作用[16]，可溶解细菌细胞膜磷脂，破坏膜蛋白结构，增加细胞膜通透性，导致细菌内容物流出进而裂解死亡，并形成胆汁酸-脂肪酸胶束，抑制细菌在肠黏膜的粘附，防止其过度生长及易位。在实验性内毒素血症的研究[17]中发现胆汁酸可通过IL-6相关途径抑制肠道BT，并能选择性抑制LPS刺激的巨噬细胞释放IL-6，从而激活胃肠黏膜下神经元以促进肠道运动。基因测序发现肝硬化腹水型大鼠肠道中大肠杆菌、志贺菌等明显增加，而经FXR受体激动剂奥贝胆酸治疗后明显减少，乳酸菌明显增加，肠道紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达升高，NF-κB介导的促炎因子TNF-α、IL-17及自然杀伤细胞介导的干扰素-γ(IFN-γ)表达降低，肠道通透性恢复，炎症减轻，BT降低(78.3%降至33.3%)[18]。由此说明胆汁酸不仅具有直接杀菌作用，减少BT，而且还可通过FXR受体改善肠黏膜屏障，降低促炎因子的表达，改善SBP的炎症反应。

4 肠道屏障功能受损

4.1 肠道机械屏障

肠上皮细胞、细胞间的紧密连接共同构成肠道机械屏障，能有效阻止肠道细菌及其代谢产物的易位。肠上皮细胞能吞噬细菌及其产生的毒素，并通过Toll样受体和Nod样受体识别病原体相关分子模式，激活肠道防御机制，促进抗菌肽等物质的分泌。肠上皮细胞间通过跨膜蛋白如闭合蛋白(occluding)、密闭蛋白(claudin)、连接粘附分子(JAM)等和支架蛋白如小带闭合蛋白(ZO)、扣带蛋白(cingulin)等相互交联，形成紧密连接，并与F-肌动蛋白和肌球蛋白组成的膜细胞骨架相互作用，形成复杂的结构，在相邻的肠上皮细胞间形成密封阻止肠腔内致病菌、毒素及炎症介质等从细胞旁途径转移[19]。Shi[20]发现CCL4诱导的肝硬化大鼠的肠黏膜破坏，肠上皮细胞微绒毛萎缩、破裂、稀疏，细胞间紧密连接破坏，肠通透性增加。同样，在肝硬化患者中肠壁结构也发生了类似改变[21]，且肠上皮中occludin和claudin-1的表达明显降低，腹水型肝硬化失代偿期患者更为明显，且血浆内毒素水平与occludin和claudin-1的表达呈负相关，表明肝硬化患者的肠道紧密连接遭到破坏，肠通透性增加，微生态失衡，细菌及内毒素易位导致腹腔感染。

4.2 肠道化学屏障

肠道中存在多种抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)，如防御素、再生胰岛衍生蛋白3(Reg3)，溶菌酶、分泌型磷脂酶A2(sPLA2)等，多是由肠上皮Paneth细胞分泌，它们与杯状细胞分泌的黏液层共同组成了肠道的化学屏障[22]。AMP对细菌及病原微生物具有直接的杀灭作用[23]，如α-防御素可在细胞膜上形成渗透孔导致细菌裂解，Reg3家族的C型凝集素、cathelicidin能导致膜电位异常进而破坏细菌细胞膜，sPLA2可水解细菌细胞膜磷脂，损害细胞膜的完整性。杯状细胞分泌的大量黏液及高度O-糖基化的粘蛋白在肠腔内形成的网状聚合物构成黏液层，不仅为共生细菌提供碳水化合物，而且能促进肠道免疫细胞分泌免疫球蛋白，并充当AMP和免疫球蛋白的粘滞陷阱，有效抵抗致病菌的入侵[24]。动物研究[25]发现CCL4诱导的肝硬化小鼠肠道抗菌肽 Reg3表达降低，肠球菌、类杆菌向肝脏转移增加，同时BT标志物可溶性CD14含量明显升高。在对肝硬化患者的研究[26]中发现肝硬化患者肠道α-防御素5、6的表达降低，失代偿期患者降低更为明显，且与血清内毒素水平呈负相关。说明肝硬化患者肠道AMP分泌的减少，对肠道细菌的抑制作用减弱，促进了BT。

4.3 肠道免疫屏障

肠道中的树突状细胞(DC)，巨噬细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、B细胞、T细胞及肠道相关的淋巴组织，共同组成了免疫屏障。肠道中革兰阴性菌(如拟杆菌等)可激活DC，并与调节性T细胞(Treg)相互作用，诱导B细胞表达分泌型IgA，阻断参与上皮粘附的细菌蛋白，诱导细菌凝集及在黏液层的封闭，防止致病菌在肠黏膜粘附和定植[27]。DC和巨噬细胞在受到病原体刺激时释放细胞因子和趋化因子，将幼稚的CD4+T细胞分化为T辅助细胞1(Th1)，Th2，Th17以及Treg，参与介导免疫反应[28]。Tsiaoussis[26]发现失代偿期肝硬化患者肠上皮T淋巴细胞特别是CD3+T淋巴细胞的减少导致肠道免疫功能低下，BT增加。Muoz等[29]发现肝硬化腹水型大鼠的肠上皮和固有层淋巴细胞表现出促炎型免疫失调，活化的淋巴细胞向Th1转化增多，Th17减少，促炎因子TNF-α、IFN-γ表达增加，抗炎因子TGF-β、IL-10表达降低，且这种转化介导了肠上皮紧密连接蛋白的破坏，进一步的研究发现这种促炎型免疫失调是肠道菌群紊乱(大肠杆菌、志贺氏菌增加，乳酸菌减少)导致的。这表明了肝硬化时肠道微生态的失衡引起肠道免疫系统的紊乱，肠屏障功能受损，BT增加，进而导致感染增加，炎症反应加重。

4.4 肠道生物屏障

肠道细菌自人出生后就立即定植于肠道，通过其定植抗性与病原微生物竞争空间和营养物质，限制肠道内致病菌的定植与增殖，并在一定程度上增强肠黏膜屏障功能、介导免疫应答、减轻炎症反应。Hayes[30]发现与无菌小鼠相比，共生菌群定植后的小鼠表现出更完整的肠屏障，共生菌群可持续刺激Paneth细胞上的病原体识别受体以促进AMP的分泌。大肠杆菌可诱导occludin和ZO-1的破坏导致肠屏障功能损害，而双歧杆菌、植物乳杆菌则增加claudins、occludin、ZO-1的表达来增强肠屏障功能[31-32]。拟杆菌、双歧杆菌将膳食纤维发酵成短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFA)，可为肠上皮细胞提供能量，并通过激活AMPK信号通路改善肠黏膜组织的局部血供，促进损伤的肠黏膜修复[33]。SCFA中的丁酸盐与G蛋白偶联受体结合后促进抗炎因子TGF-β、IL-10的产生，激活Treg细胞，降低促炎因子IL-6、IL-12水平，下调NF-κB介导的炎症反应[28]。由此可知肠道菌群及其代谢产物可通过不同方式影响肠屏障功能，而SBP时肠道微生态的失衡则促进了肠屏障功能的受损。

5 免疫功能障碍、炎症反应与SBP

肝硬化患者的免疫功能障碍，肝脏巨噬细胞识别和清除能力及循环单核细胞抗原呈递能力下降[34]。易位的细菌及其代谢产物作为病原体相关分子模式(PAMP)与肝细胞损伤或坏死释放的损伤相关分子模式(DAMP)通过识别肠道及肝脏细胞上的模式识别受体(如TLR或NLR)激活免疫及炎症反应[35]。PAMP中的脂多糖能识别TLR4，通过AKT-MTOR和AMPK-ULK1信号通路诱导肝星状细胞(HSC)自噬，HSC中的脂质含量降低、视黄酸信号功能障碍、转化生长因子(TGFB)下调，导致HSC对TGFB信号敏感，胶原蛋白大量产生和沉积，进而促进肝纤维化的进展[36]。此外鞭毛蛋白可激活TLR5、含有未甲基化CpG-二核苷酸的细菌DNA可激活TLR9、脂蛋白和肽聚糖激活TLR2及NLR2，这些受体激活后则介导NF-κB和MAPK信号通路，最终诱导促炎因子(如TNF-α、IL-4、IL-6、INF-γ、IL-8)及趋化因子(MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2)的大量释放，促进炎症级联反应，加重肝脏损害[37]。PAMP和DAMP尚可激活炎症小体NLRP3，进一步激活caspase-1而产生促炎因子(如IL-1β和IL-18)加速炎症反应[38]。杨振二[39]研究发现肝硬化SBP患者血清肠黏膜屏障指标D-乳酸、内毒素、二胺氧化酶水平升高，且腹水中炎症因子(IL-1β、IL-2、IL-17、IL-22)表达升高，表明SBP患者肠黏膜屏障受损后炎症因子大量易位至腹水。而腹水中补体C3、C4浓度明显下降、中性粒细胞吞噬及胞外网状陷阱功能(Nets)降低等导致腹水内源性抗菌活性不足而无法及时清除易位的细菌及炎症介质也近一步而导致腹腔甚至全身感染的发生[40-41]。

6 基于肠道微生态防治SBP

鉴于肠道微生态与肝脏疾病之间的密切关系，近年来调整肠道微生态已成为防治肝病的重要靶标。微生态制剂是生理性活菌制品，其通过外源性补充肠道益生菌，竞争性抑制致病菌的增殖来恢复肠道微生态的平衡。相关研究[42-45]发现多种益生菌的使用可改善肝硬化患者的肠道微生态紊乱、减少BT，并能增加紧密连接蛋白claudin、ZO及AMP的表达改善肠屏障功能，同时增加血清新蝶呤水平及嗜中性粒细胞诱导产生活性氧改善免疫功能，此外还能降低内毒素水平及促炎因子(TNF-α、IL-6)、趋化因子(MCP-1、MIP-1β、MIP-3α)的表达而减轻炎症反应。

粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)是将健康人的新鲜粪便进行过滤、离心等加工制作成为粪菌液通过鼻饲、灌肠、结肠镜下肠内输液等方式输注到受菌者消化道内的一种现代新型粪便细菌疗法。相较于单一或多个菌种的益生菌制剂而言，FMT具有菌群种类丰富、数量巨大等优点，更有利于恢复肠道菌群的正常功能，促进肠道微生态平衡。FMT已在大量的RCT研究中证实在艰难梭菌感染和炎症性肠病等的治疗中卓有成效，近年来在肝脏相关疾病中应用的研究也越来越多。Philips[46]在一项初步临床研究中发现FMT可纠正严重酒精性肝炎患者的肠道菌群紊乱，并在一定程度上改善患者的临床症状、生化指标及MELD评分。Bajaj[47]发现FMT能恢复HE患者肠道微生物功能，增加AMP如防御素-5的分泌，并降低血清内毒素结合蛋白和IL-6水平，改善全身性炎症环境及认知功能。在FMT干预高脂饮食诱导的小鼠脂肪性肝炎的动物研究[48]中发现FMT后肠道拟杆菌门丰度降低，厚壁菌门、放线菌门及肠道总菌群丰度增加，肠道中丁酸盐浓度及紧密连接蛋白ZO-1的表达升高，血清内毒素及促炎因子TNF-α、IL-6、IL-17、IFN-γ水平降低，抗炎因子IL-4、IL-22、Treg水平升高。表明FMT能在一定程度上纠正肠道微生态的紊乱，改善肠屏障，同时纠正促炎和抗炎因子的失衡，改善肝脏免疫功能。国内学者徐元红等[49]用FMT疗法治疗1例肝硬化SBP患者，发现治疗后腹膜炎症状消失，肠道双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌等有益菌种明显增加，白细胞、中性粒细胞比值恢复正常，肝功能好转，表明FMT可在肝硬化SBP的治疗中发挥重要作用。但当前对于FMT治疗肝病的临床研究尚处于起始阶段，其技术尚未完全成熟，粪菌制备工艺、质量保证、致病菌剔除、最佳输注粪菌数量、最佳输注途径、最佳治疗疗程等尚未有统一标准，其安全性及有效性亟需大样本多中心的RCT实验证实。

孕烷 X 受体(Pregnane X receptor, PXR)是一种配体激活的转录因子和核受体，广泛分布于肝脏和肠道中，最近研究[50]发现PXR激活剂银杏内酯A(Ginkgolide A, GA)可增加CCL4诱导的肝硬化小鼠肠道紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达，降低肠通透性和肠内毒素渗漏，改善肠屏障功能，减少BT。此外GA尚可激活PXR进而抑制TLR4/MYD88/NFκB轴降低其下游炎症介质TNF-α、IL-6、INF-γ的表达。不仅如此，GA还可能增加抗菌肽Reg3A的分泌减轻SIBO和BT。表明PXR在维持“肠-肝轴”平衡中起重要作用，可作为治疗肝硬化的潜在靶点，而PXR激活剂GA或许会在防治肝硬化及其并发症中发挥积极作用。

7 总结及展望

SBP是肝硬化严重并发症，具有高发病率、高复发率、高死亡率的特点。近年来由于细菌耐药性增加，使得从肠论治SBP的非抗生素疗法成为当前的研究热点，基于调整肠道微生态的益生菌、益生元制剂及FMT能抑制肠道细菌过度生长、促进肠屏障功能恢复、改善免疫功能、纠正肠道菌群紊乱、恢复肠道微生态平衡，已成为防治肝硬化SBP的重要策略。但由于“肠-肝轴”的存在，肠道微生态与SBP之间的关系复杂，仍需要深入研究其内在机制以阐明肠道微生物群在肝硬化SBP中的病理生理作用，而研发出靶向肠道微生态的更安全高效的新型产品及高效疗法也将是未来需要深入研究的方向。值得一提的是最近基于微生物代谢物的疗法[51]备受重视，部分学者称其为“后生元”，其可靶向微生物组的下游信号通路，并通过减轻这些通路中涉及的代谢物过量、稀缺或失调的负面影响来发挥作用。因此，以微生物代谢物为基础的治疗药物有望会成为防治SBP的有效疗法。同时对于核受体PXR，胆汁酸受体FXR、TGR5的研究也可能成为防治肝硬化SBP新的切入点。