血管紧张素转换酶2在SARS-CoV-2感染中的作用机制研究进展

王荟，吕巧怡，赵杨静，吴皓杰，邵启祥

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏省检验医学重点实验室，江苏 镇江 212013)

1 SARS-CoV-2与COVID-19概述

2019年底一场不明原因的肺炎暴发于湖北武汉，随后确认为新型冠状病毒感染，该病毒最初被命名为2019-nCoV，2019年2月11日，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将新型冠状病毒(2019-nCoV)官方命名为重症急性呼吸道综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，同一天世界卫生组织(WHO)将该病毒感染引起的疾病命名为2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)。COVID-19虽然病死率低于SARS，但由于感染后潜伏期具有感染性而变得很难控制，导致感染人群基数很大。老年和伴有基础疾病的患者感染后往往病情更严重，具有不良预后，严重威胁患者生活和健康[1]。

SARS-CoV-2属于β-冠状病毒属，与2种蝙蝠冠状病毒亲缘性很近，目前猜测菊头蝠可能是其自然宿主[2]。SARS-CoV-2利用其Spike蛋白(S蛋白)与宿主细胞血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合，从而进入细胞。SARS-CoV-2与SARS-CoV的差异较大，被认为是一种新型的人类感染性β冠状病毒。SARS-CoV-2可通过呼吸道传播进入鼻咽部，部分研究表明SARS-CoV-2也可能通过消化道、结膜等途径进入机体[3]。COVID-19患者主要临床症状为发热、乏力、干咳等，住院期间可发展为肺炎、急性呼吸窘迫症和休克[4]。然而研究发现除了肺部损伤外，突然加重的病情包括急性心肌损伤、心律不齐和急性肾损伤等并发症[5]。因此，SARS-CoV-2 感染后损伤的不只是肺部，可能导致全身多个脏器损伤。SARS-CoV-2通过不同途径传播、损伤不同组织器官的特点与ACE2的表达情况、机体的免疫状态有关。

2 SARS-CoV-2结合ACE2的结构解析

SARS-CoV-2主要利用其表面突触蛋白S蛋白的受体结合结构域 (receptor binding domain,RBD) 结合ACE2。Yan等[6]率先采用冷冻电镜技术成功解析了ACE2全长结构，发现ACE2以二聚体形式存在，无论开放或关闭状态都包含一个共同识别SARS-CoV-2的表面。Lan等[7]利用X射线衍射技术准确定位了SARS-CoV-2的RBD与ACE2的结合位点。Wrapp等[8]利用冷冻电镜成功解析了SARS-CoV-2的S蛋白三聚体结构，发现SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2的亲和力是SARS-CoV的S蛋白和ACE2结合的10倍，从分子层面解析了SARS-CoV-2具有强感染性的原因。然而Walls等[9]发现SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白与人ACE2具有相同的结合能力，结构学研究发现SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白膜融合区域S2亚基高度保守。Shang等[10]发现与SARS-CoV的RBD相比，SARS-CoV-2中的RBD与ACE2结合可形成更紧凑的构象，其中部分氨基酸残基的改变稳定了RBD-ACE2上的两个病毒结合热点，这些结构特征增强了与ACE2结合的亲和力。部分遗传学和结构学研究表明SARS-CoV-2的S蛋白被多种人体组织(包括肺、肝和小肠)中的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2活化，其他宿主蛋白酶如furin被认为对人畜共患病传播至关重要，在气道上皮细胞、心脏组织、肠道均有表达，可促进SARS-CoV-2进入宿主细胞[11]。

3 ACE2的组织表达与SARS-CoV-2感染

SARS-CoV-2和2003年爆发的SARS都通过ACE2感染机体[2]。单细胞测序结果发现ACE2表达在肺脏、心脏、肾脏、食管、膀胱、回肠、睾丸等不同器官，这些器官可能成为病毒攻击的靶器官，而临床报道也验证了这一推测，因此SARS-CoV-2可能通过不同的途径感染机体[12]。SARS-CoV-2可与支气管上皮和人类Ⅱ型肺泡上皮细胞表面广泛表达的ACE2结合，从而引起下呼吸道症状[13]。有报道发现近一半COVID-19患者以食欲缺乏、乏力、精神萎靡、恶心呕吐和腹泻等消化道症状为首发症状，这不仅可能与ACE2高表达于小肠近端和远端上皮细胞有关，还与ACE2参与调节小肠炎症和腹泻有关[14]。近期发现有少数治疗后“复阳”的患者也与肠道感染有关，病理结果发现尽管这些“康复患者”呼吸道检测病毒为阴性，但胃肠道仍为阳性，且在肠道固有层中浸润有大量的浆细胞、淋巴细胞，但多数患者肠道的损伤并不严重，仅表现为间质水肿。因此认为SARS-CoV-2可能破坏了肠道对微生物的屏障功能[15]。Chai等[16]利用生物信息学数据库分析30余种恶性肿瘤遗传和表观遗传学数据，发现ACE2在多种肿瘤组织中高表达，因此肿瘤患者可能对SARS-CoV-2更加易感。肿瘤患者ACE2高表达同时还伴有ACE2突变、拷贝数异常、启动子区甲基化等异常，从而影响ACE2的生理功能。Cao等[17]发现东亚人群中ACE2 相关eQTL变异具有更高的等位基因频率，这提示可能不同人群存在不同易感性。

4 ACE2参与免疫炎症调节

除了作为病毒结合的受体，ACE2还参与调节免疫过程。在SARS-CoV感染的小鼠模型中发现S蛋白可下调ACE2的表达，并诱导ACE2胞外区脱落。人气道上皮细胞分泌的金属肽酶域17(metallopeptidase domain 17，ADAM17)和炎性细胞因子也可剪切膜表面的ACE2，使其脱落形成可溶性的ACE2，但引起普通感冒的冠状病毒并不引起ACE2脱落[18]，因此推测可溶性的ACE2可能在COVID-19炎症反应中发挥重要作用。但Monteil等[19]最近利用细胞、类器官培养研究却发现重组可溶性ACE2可阻断SARS-CoV-2的感染，这种重组的可溶性ACE2可通过在细胞外结合SARS-CoV-2发挥中和病毒作用从而阻断感染。生物信息学分析发现肺癌组织中ACE2表达增高，存在miR-125b-5p-ACE2-IL6轴的调控作用，且miR-125b-5p促进ACE2表达，但抑制IL-6的表达，而SARS-CoV-2感染引起ACE2表达下调，可能会上调IL-6表达，引发细胞因子风暴，也称为细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)，因此肺癌患者合并SARS-CoV-2感染，可能导致更为严重的细胞因子风暴和肺炎症状[20]。ACE2还广泛表达于血管内皮细胞，这对调节血管张力和维持血管均质状态是必不可少的。血管内皮细胞感染SARS-CoV-2后可招募免疫细胞并诱导自身凋亡，从而活化凝血系统，导致微循环功能障碍，进而引起心血管系统的缺血、出血、炎症和功能障碍[21]。ACE2的表达下降也可引起肾素-血管紧张素系统紊乱，导致血管通透性增加，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是其中的关键效应物，过多的AngⅡ可通过ADAM17切割肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-6，产生可溶性IL-6，进一步加剧炎症反应。值得一提的是，最近研究发现ACE2属于人干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)，当机体感染SARS-CoV-2产生干扰素(interferon，IFN)抵抗病毒的同时，IFN-α上调ACE2的表达，促进更多的SARS-CoV-2侵入宿主细胞，这可能是某些患者快速进展的原因之一[22]。单细胞转录组测序分析发现ACE2在鼻分泌细胞和纤毛细胞中表达最高，因此鼻内给药有可能限制病毒感染，同时ACE2共表达分析发现鼻黏膜还表达天然免疫相关基因，这些基因表达可能与降低病毒敏感性有关。而在Ⅱ型肺泡细胞中ACE2与多个病毒组装复制相关的基因共表达，如小窝蛋白(caveolin)可促进病毒更易被吞噬[23]。不同组织ACE2表达和免疫特征联合分析显示，不同个体免疫反应具有差异性，男性可能具有更高的病死率[24]。此外，胸腺和骨髓是机体T细胞和B细胞的发育场所，研究表明胸腺和骨髓中也表达ACE2，可能成为病毒感染的靶器官[25]。

5 不同性别ACE2表达差异与疾病易感性和严重程度相关

许多研究观察到COVID-19男性的发病率要显著高于女性，同时重症率和病死率也高于女性。研究表明吸烟会影响ACE2的表达，这也可能是男性患者更易感原因之一[26]。此外，共表达网络分析发现，ACE2和雄激素受体表达呈正相关，染色质免疫共沉淀测序结果提示雄激素受体可能与ACE2上游的增强子区域结合；单细胞RNA测序结果显示男性的前列腺和睾丸中ACE2普遍表达，是SARS-CoV-2感染的潜在靶器官[27]。以往研究发现中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus,MERS-CoV) 和SARS-CoV感染中男性患者数也高于女性[28]，推测可能与X染色体相关的基因和性激素的差异有关。同时研究表明SARS-CoV-2在进入宿主细胞时依赖宿主的Ⅱ型踦膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白[29]，该蛋白酶受雄激素调控。通过对男性和女性表达ACE2的细胞进行细胞因子差异表达分析后发现，促炎细胞因子特别是IL-6的受体在男性肺部多种细胞高表达，提示男性可能较女性更容易发生CRS[30]。

6 高龄和慢性并发症患者ACE2变化与预后更差相关

高龄常作为SARS不良反应与死亡率预测的独立危险因素，对于60岁或60岁以上的人群，SARS相关的死亡率可能超过50%[31]。高龄伴有并发症也是与MERS-CoV感染、严重程度和死亡率相关的因素[32]。60岁以上老年人胸腺体积只有年轻人的1/10，几乎不会产生初始T细胞，主要依靠外周免疫系统维持，因此对新发病毒感染的抵抗力较弱。不同组织ACE2表达和免疫特征联合分析显示，不同宿主免疫反应具有差异性，老年人可能具有更高的病死率[24]。代谢性炎症会损害免疫系统，降低机体应对感染的能力，损害愈合过程，延长恢复时间。

临床数据显示高血压、血管疾病患者感染SARS-CoV-2比例较大，而血管紧张素受体阻滞剂(ARB)沙坦类药物和ACE抑制剂都能上调高血压患者的ACE2表达，高脂肪和糖尿病也能上调ACE2表达[33]。因此具有慢性基础疾病的患者ACE2表达增高可能导致其对SARS-CoV-2更加易感，但感染SARS-CoV-2后ACE2表达过低，可能破坏肾素-血管紧张素-醛固酮系统，导致多器官衰竭。

7 针对ACE2的靶向治疗药物、抗体和疫苗研究

SARS-CoV-2的S蛋白通过ACE2入侵细胞是感染机体的第一步，阻断S蛋白和ACE2的结合可以有效阻止SARS-CoV-2的感染。针对ACE2化学药物的临床应用与新药研发可能达到有效预防与治疗的临床效果。氯喹不仅具有抗疟疾作用，还具备广谱的抗病毒作用，其作用机制之一是氯喹可通过干扰宿主细胞ACE2末端糖基化从而影响S蛋白与ACE2的结合[34]。ACE抑制剂和他汀类降血压药物对非病毒性肺炎及无基础疾病的患者具有临床疗效，而对COVID-19患者的临床疗效还有待充足的临床试验研究证明[35]。此外，重组ACE2蛋白被证明可有效阻止病毒入侵[19]。

Tian等[36]比对发现SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的RBD相似度为73%，因此针对两种病毒的抗体可能具有交叉反应，从SARS-CoV单克隆抗体库中筛选可能治疗SARS-CoV-2的中和抗体，通过比较多种SARS-CoV单克隆抗体与SARS-CoV-2 RBD结合的亲和力，发现CR3022抗体具有较强结合SARS-CoV-2的能力，但并不能确定其具有中和活性。特异性中和抗体治疗可以有效阻止病毒通过ACE2入侵，研究发现靶向SARS-CoV 的S蛋白的特异性中和抗体(m396、CR3014)虽然能阻断其与ACE2的结合，但却无法与SARS-CoV-2的S蛋白结合，这一结果提示SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白RBD的差异影响其与中和抗体的交叉结合反应，因此现有的SARS疫苗能否预防SARS-CoV-2感染尚不能确定。除了在SARS病毒抗体库中筛选针对SARS-CoV-2的抗体外，还可从COVID-19康复患者体内分离分泌中和抗体的B细胞克隆，以筛选针对SARS-CoV-2的特异性单克隆抗体。Ju等[37]从COVID-19康复者外周血中筛选与SARS-CoV-2的RBD具有较强结合和中和能力，但与SARS和MERS病原体无交叉的抗体克隆，结果获得206个B细胞克隆，通过测序获得抗体编码基因。Chen等[38]利用单个B细胞克隆的方法，从COVID-19患者分离出2个能分泌高中和活性抗体的B细胞克隆311mab-31B5和11mab-32D4，两者的IC50分别为0.033 8和0.069 8 μg/mL。然而文献表明非中和抗体可通过巨噬细胞的吞噬作用促进病毒在体内播散，或引起抗体依赖性增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)，或通过巨噬细胞表面的免疫球蛋白Fc受体进一步刺激炎症细胞因子释放，加剧CRS，而高亲和力的单克隆抗体则不容易诱导ADE效应[39]。因此，从COVID-19患者体内获取的高亲和力单克隆抗体可能在治疗和控制疫情方面发挥较大作用。恢复期血浆具有较好的耐受性[40]，可能通过中和病毒血症改善临床疗效，与康复者血浆相比，单克隆抗体特异性高，也更容易生产和大规模制备，但筛选的单抗需要进一步临床试验进行有效性评估。

抗体治疗主要通过中和病毒，阻止病毒入侵宿主细胞，还可介导免疫调理和抗体依赖性细胞介导的细胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytoto-xicity,ADCC) 作用以清除病毒，但这是一种被动免疫，持续时间很短，主要用于紧急预防和治疗；而疫苗介导的是主动免疫，主要用于疾病预防。通过测序掌握SARS-CoV-2基因组，成功解析S蛋白及ACE2晶体结构对理解SARS-CoV-2如何入侵靶宿主细胞和疫苗设计提供了重要结构基础。目前发现SARS-CoV-2的S蛋白较为保守，尚未发现产生变异，且其中的RBD在与ACE2结合过程中发挥决定性作用，因此SARS-CoV-2疫苗主要针对S蛋白或其RBD设计。除了重组蛋白疫苗外，目前同步开展研究的还有减毒活疫苗、牛痘苗嵌合疫苗、灭活病毒疫苗、亚单位疫苗、重组DNA和蛋白质疫苗的实验研究和临床试验[41]。

8 结语

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎大流行是一个全球性的卫生挑战，ACE2是SARS-CoV-2进入宿主细胞并造成靶器官损伤的重要受体。本文主要阐述了ACE2参与的免疫炎症过程的机制，分析了性别、年龄和基础疾病等因素与ACE2表达差异及预后的联系。通过对SARS-CoV-2结合ACE2的结构解析有助于研发阻断病毒和受体有效结合的药物靶点。目前不同类型疫苗和中和抗体的研究正在同步进行中，部分项目初期临床数据较好，新冠疫苗和中和抗体有望成为抗疫主力应用于临床预防和治疗。