重定位策略在罕见病治疗药物中的应用研究进展

任淑月,孙岚,杜冠华

(1. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所,北京 100050； 2. 中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，北京 100021)

世界卫生组织(WHO)定义导致总人口0.65‰～1‰人群患病的疾病为罕见病[1]。尽管这个比例很低但疾病总数已高达8 000种，全球受罕见病影响的人数高达3.5亿[2-3]。很多罕见病在生命早期发生，约有30%罕见病儿童在5岁前死亡，甚至约35%的罕见病婴儿在出生后第一年死亡[4]。

罕见病的治疗药物称之为孤儿药。大部分的罕见病与遗传及基因突变有关[5]，其病理生理、病因及疾病的历史演变未知等因素影响孤儿药的研发进程。考虑到罕见病人数少及患者地理分布散落、临床样本稀缺[6]、药物的研发周期长(13～15年)、费用高(20～30亿美元)、成功率低(10%)、收益甚微等诸多因素[7]，很多医药企业对孤儿药的研发望而却步。为解决这一现状与罕见病临床用药迫切需求之间的矛盾，近年来各国均对罕见病的药物研发实施积极鼓励的政策，并特别成立了很多平台来满足科研需求。罕见病专家和倡导者Ségolène Aymé创建的Orphanet(孤儿病联盟)旨在通过40多个国家的组织机构合作，提供关于罕见病高质量的数据及可靠的临床指导[8]，以使研究者们共享信息，科学分析进而促进药物研发。美国国立卫生研究院遗传与罕见病信息中心提供了罕见病及孤儿药相关的综合信息[9]，以及美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)发布的罕见病用药现代化计划，加快了积压遗留的罕见病用药资格认证[10]。在我国，2016年已启动了国家罕见病注册系统(national rare diseases registry system of China,NRDRS)建设罕见病临床队列研究项目，旨在阐述罕见病的临床信息和组学信息，阐释罕见病的发病机制，最大限度地为孤儿药临床试验提供便利[11]。

目前罕见病的治疗方法包括小分子药物、单克隆抗体、蛋白质替代疗法、寡核苷酸、基因和细胞疗法以及药物重定位(drug repositioning,DRP)[12]。近年来随着计算机技术的发展，应用DRP策略研发孤儿药获得越来越多的研发人员青睐。DRP是一种发现现有药物或宣布撤市化合物新适应证的方法[13-14]，这些药物或化合物的药代动力学特征及安全范围已知，有些甚至已经进入临床Ⅱ期或Ⅲ期试验阶段，因此其研发可以跨过药物发现甚至临床前阶段，具有批准快(3～12年)、费用低(50%)、成功率高(30%)等特点[15-16]。重定位药物开发上市一般需要三步：候选药物的确定；药物临床前评价及作用机制研究；Ⅱ期临床试验评估疗效，其中第一步在整个重定位研究中发挥至关重要的作用[17]。DRP已不是一个新的概念，目前DRP的策略转化是从偶然发现已有药物新适应证到系统、合理地寻找药物的可能。常规疾病治疗药物用于罕见病治疗大多数是基于临床意外发现，这对8 000多种罕见病的药物研发无疑是一个很大的障碍。计算机辅助药物发现是一种比传统药物研发更便宜、更快速的方法，主要通过药物靶点结合预测、计算机网络分析及基因疾病信号分析等方面而实现，为孤儿药研发提供了广阔的前景[18]。本文综述了三种DRP策略在孤儿药研发中的应用，以期为后期药物研发提供借鉴及思路。

基于DRP策略寻找孤儿药得到越来越多研发者的关注，目前DRP的方法包括偶然或系统性临床回顾分析发现已有药物的不良反应、体外高通量筛选化合物以及计算机辅助药物发现[19]。

1 偶然或系统性临床回顾分析

偶然或系统性临床回顾性分析是基于意外发现药物新的适应证，虽然没有经过理性设计，也未能阐明药物在新适应证中的作用机制，但其促进了药物重定位策略的推广[20]。

肺动脉高压是进行性肺血管重构导致右心室后负荷加重，进而造成右心衰竭的一种罕见病[21]。尽管目前全球批准治疗肺动脉高压的药物有14种，但还不能实现提高生存率[22]、减少严重的不良反应及治疗特异性等目标。面对新药研发的高投入、长周期等特点以及肺动脉高压药物研发的困难，DRP有望为肺动脉高压治疗药物研发提供新策略[17]。钙通道阻滞剂(calcium channel blockers,CCBs)通过降低细胞内钙离子水平而最早在高血压患者中使用[23]，20世纪80年代，研究人员发现高剂量的CCBs可以提高肺动脉高压患者的生存率，截至目前CCBs仍作为肺动脉高压的有效治疗药物[24]。西地那非属于5型磷酸二酯酶抑制剂，1991年已被批准用于治疗心绞痛，但由于其与硝酸盐及其他物质反应，后被终止使用。研究人员通过临床回顾性分析发现西地那非可改善勃起功能障碍，于1998年批准其用于治疗勃起障碍。进一步根据其对血管生物学的影响，发现西地那非还与肺循环有关，并于2005年批准其治疗肺动脉高压[25-26]。

普萘洛尔是由1988年获得诺贝尔生理学或医学奖的詹姆斯·布莱克爵士开发用于治疗心绞痛和高血压的非选择性β肾上腺能受体阻断剂。大部分的小儿血管瘤是不需要治疗而可以间断性退化的，但10%～15%的增生性小儿血管瘤会引发威胁生命的并发症，因此需要寻找治疗方法以缓解患者病痛。而选择普萘洛尔治疗增生性小儿血管瘤是基于偶然发现的。Léauté-Labrèze等[27]使用糖皮质激素治疗鼻腔毛细血管瘤时，患者出现梗阻性肥厚型心肌病等不良反应，应用普萘洛尔时偶然发现其可能在控制血流动力学及血管生成中产生重要作用，使得鼻腔毛细血管瘤变软，颜色也随之发生变化。经过大量临床试验研究最终通过美国FDA和欧洲药品管理局的批准用于小儿血管瘤的治疗[27]。

Hutchinson-Gilford早老综合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)是一种极罕见的疾病，可引起组织快速衰老并伴随严重的动脉粥样硬化症状，进而导致患者6至20岁阶段死亡，平均寿命为14.5岁[28]。HGPS的主要病理机制是LMNA基因突变导致早衰蛋白A表达异常进而引起对细胞核稳态的毒性作用。前期用于治疗癌症的Lona-farnib是一类法尼基转移酶抑制剂，其在一项临床随机试验中表现出改善心血管及骨骼疾病方面的特性[29]，进一步经过2.2年的临床试验给予早衰患者每天2次服用150 mg Lonafarnib后，与未给药组相比能明显降低患者的死亡率[30]。

2 体外高通量筛选化合物

体外高通量筛选是一种通过对大量样品和化合物的测定来发现药物的方法，主要基于机器人技术、液体处理、高通量成像和数据分析等流程来实现，具有经济、快速和便于推广等特点。细胞是人类疾病的重要模型，具备大量繁殖培养、适用于遗传分析等特征，将其作为体外高通量筛选的模型，可以提前确定药物敏感性，扩大药物覆盖范围和提高研发效率[31]。

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)是一种消化道间叶性恶性肿瘤，能够生长于胃肠道的任何部位，胃和小肠较为常见，结直肠次之[32]。大约85%的GISTs是由血小板源性生长因子受体A (platelet-derived growth factor receptor A,PDGFRA)和酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor,TKR)C-kit突变引起的[33]。目前治疗GISTs的标准方法仍是手术切除，但是存在术后复发率高的风险。Pessetto等[34]基于定量药物筛选方法从796个FDA批准的药物中，体外筛选出金诺芬和磷酸氟达拉滨，具有抑制GISTs细胞增殖的效应。活性氧的过量产生和抗氧化系统(如TrxR系统) 受损可能导致氧化应激，而氧化应激与包括癌症在内的多种疾病的发病机制有关。研究人员进一步发现，1985年批准治疗类风湿关节炎的金诺芬具有抑制TrxR酶活性并诱导活性氧生成，抑制GISTs细胞生长和降低生存活力的效应，这对GISTs的治疗可能有很好的效果。

进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP)是一种全球患病率约为1/200万的罕见病，超过95%的FOP是由骨形态发生蛋白1(BMP)受体ACVR1/ALK2的反复突变(617G>A; R206H)引起的[35-36]。突变的受体引起Id1转录因子的上调。Yamamoto等[37]通过筛选1 040种FDA批准的药物，寻找具有抑制ACVR1/ALK2突变小鼠的C2C12成肌细胞中Id1启动子效应的化合物，最终确定马来酸哌克昔林具有治疗FOP的潜力。

3 计算机辅助药物发现

当今，大量疾病的生物学数据正在不断产生，如果我们单纯基于临床和传统药物重新定位方法发现药物，则无法扩展和利用这些不断增长的数据。因此，亟须准确而有效的计算方法来充分利用这些数据，以提出最有价值的线索，供研究者考虑，并使研究人员摆脱由于大量数据而引起的混乱[38]。

3.1 基于疾病-药物信号网、通路分析

针对孤儿药的研发，Brylinski等[39]建立了eRepo-ORP数据库，旨在基于Drug Bank、PDB数据库、Orphanet平台以及eThread和eFindSite算法提取出31 142个潜在的罕见病治疗药物-靶点对，这在很大程度上为孤儿药的研发明确了方向。为了寻找已知药物的新结合靶标，Pulley等[3]开发了eMatchSite计算机程序。将eMatchSite程序和基于结构的虚拟筛选相结合，系统地模拟了已知药物与980例罕见病相关蛋白的药物-靶标复合物。Khaladkar等[40]利用2016年创建的Open targets平台上已有全基因组信息，通过药物靶点-疾病网络发现820个已证实或潜在的药物治疗靶点具有2 540个新的适应证，这将促进已有药物的重新定位。

肾上腺皮质癌是一种无有效治疗方法的罕见病，尽管前期报道米托坦可治疗肾上腺皮质癌，但其在患者群体中响应很低，因此寻找肾上腺皮质癌的治疗方案迫在眉睫。Lotfi等[41]应用Heter-LP重定位方法根据药物、疾病和靶点之间组成的异构网络挖掘肾上腺皮质癌治疗药物。他们首先建立三个有关药物、疾病和靶点的同构网络和三个关于药物-疾病、药物-靶点和疾病-靶点的异构网络。接下来进入DT-Hybrid投射阶段，研究人员基于异构子网络计算每个概念对应的拓扑相似度，并将这种拓扑相似性与同构子网络相结合，最终应用标签传播算法使药物、疾病和靶点之间产生新的预测联系。他们通过上传米托坦治疗肾上腺皮质癌的靶点hsa:1584和 hsa:2230，从11 140种药物中获得has：1584-螺内酯和has：2230-黄素腺嘌呤二核苷酸药物-靶点网络，同时has：1584-螺内酯网络得到了进一步确认；基于药物-疾病网络分析11 140个药物，结果提示促皮质素具有治疗肾上腺皮质癌的潜力；通过Heter-LP对疾病-靶点网络深度分析，从5 568个可能靶点中筛选出hsa:3480(IGF-1R)、hsa:7153(TOP2A)、hsa:1717(DHCR7)、hsa:4157(MC1R)和hsa:4215(MAP3K3)5个更具有治疗潜力的靶点。Heter-LP计算机重定位方法获得的结果对肾上腺皮质癌的后期药物研发提供了指导。

3.2 基于体外筛选联合基因、疾病信号和全基因组关联(GWAS)分析

大多数罕见病有遗传病因，52 944种与罕见病相关的遗传突变中单核苷酸突变、缺失和重复是最常见的突变类型[42]。研究者可以基于下一代基因测序技术(全基因组测序、全外显子测序以及靶向测序)，比较罕见病患者与健康志愿者之间的差异基因，进而基于罕见病患者的差异基因组，利用生物信息学的方法来寻找治疗药物[43]。

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种罕见的、无法治愈的呼吸系统疾病，主要表现为肺组织坏死和瘢痕出现，一般于确诊后2～5年死亡[44]。研究人员通过NCBI数据库获得健康和不同阶段IPF患者人群的肺组织基因表达数据集，继而通过R/Bioconductor package Limma和Netwalker数据分析软件分别筛选出不同阶段前150个上调基因和150个下调基因，并通过连通图(connectivity map,CMap)、LINCS(library of integrated network-based cellular signatures)和Spiedw DRP工具分析以上两个基因列表进而确定潜在治疗药物，进一步通过综合药物重定位打分重新排列潜在药物。研究者从结构和生物学特性上比较这些药物与FDA批准或潜在的治疗IPF药物之间的差异，并进一步寻找与这些重定位药物结构相似的天然化合物，同时也对IPF相关的microRNA和重定位药物相关的microRNA进行比较。结果显示，氯硝柳胺在IPF各个阶段都获得高分，从结构相似性方面考虑，氯硝柳胺与其他的IPF潜在抑制剂结构相似，并综合考虑安全性等问题后，其被推荐进入临床研究阶段治疗IPF。同样，结果提示茴香霉素和嘌呤霉素也有治疗IPF的潜力。尼达布尼已被FDA批准治疗IPF，研究人员基于microRNA比较研究发现hsa-miR-25-3p 和 hsa-miR-208a-5p具有抑制尼达布尼的治疗靶点作用，因此这也提供了一种新的基于microRNA寻找治疗IPF的方法[45]。

努南和豹斑综合征(Noonan and Leopard syndromes,NS和LS)是一组具有重叠表型特征的常染色体显性遗传病，存在多器官和系统异常的特征，包括心肌肥厚、短身材、胸部畸形和面部畸形等[46]。尽管目前还没有批准的治疗药物，但是前期的研究发现PTPN11基因的错义突变分别与50%的NS和70%的LS有关[47]。研究人员通过人为诱导NS 和 LS患者的多功能干细胞获得转录组，以转录组为纽带，基于CMap连通图和L1000技术，根据疾病和药物相对的转录组是否匹配最终找到61个潜在治疗NS的化合物和43个治疗LS的化合物[48]。这为NS和LS的治疗药物研发明确了方向。

4 讨论与总结

大多数重定位的药物药代动力学及安全剂量已知，但是在不同的疾病或病理条件下可能会表现出不同的药代动力学参数，甚至导致没有治疗效果。恶性胸膜间皮瘤是一种原发于胸膜、侵袭性高、极少见的恶性肿瘤[49]，没有标准的治疗方法。恶性胸膜间皮瘤的潜伏期约为40年，一旦确诊，未经治疗的预期寿命不到12个月[50]。目前应用重定位策略寻找治疗恶性胸膜间皮瘤的潜在药物多达11类，大量药物只在体外或动物体内进行验证，只有丙戊酸[51]，沙利度胺[52-53]和唑来膦酸[54]三者进入临床评估，没有表现出显著的治疗效果。用于皮肤过敏或过敏性鼻炎的H1-抗组胺药物Latrepirdine具有神经保护和增强认知的效果，将其重定位至亨廷顿式病中，尽管动物模型中显示出治疗效果，但在Ⅲ期临床试验中因没有疗效而宣布失败[55]。头孢曲松重定位在肌萎缩侧索硬化症的临床Ⅰ/Ⅱ期表现出很好的前景，但是Ⅲ期试验仍以失败告终[56]。新生儿先天性高胰岛素血症(congenital hyperinsulinism，CHI)是引起新生儿持续低血糖的主要原因，会导致婴儿脑损伤、发育迟缓或学习障碍[57]。氯噻嗪和生长抑素类似物奥曲肽在治疗CHI时会有脱靶效应并产生不良反应。而高胰岛素血症和β细胞增生的可能机制涉及雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途径的组成性激活，前期的文献报道mTOR的抑制剂—西罗莫司对氯噻嗪和生长抑素类似物耐受的患者有治疗效果[58]，进一步基于4例患者的基因表达谱发现，雷帕霉素具有抑制β细胞扩张和增殖的效果[59]，为了推广雷帕霉素的使用，研究人员增大患者数量至10人[60]，发现雷帕霉素产生的效果并没有氯噻嗪和奥曲肽的明显，甚至会产生严重的不良反应，导致雷帕霉素治疗CHI的研究不得不宣布停止。因此，基于DRP策略研发孤儿药时，在应用新技术新方法的同时，还应充分考虑临床病理的复杂性而谨慎地做出全面评估。

尽管应用DRP策略研发孤儿药存在失败的风险，但相比一个全新的实体药物研发过程，DRP已经很大程度上缩短了研发周期，提高了研发效率，仍然是一个很有前途的领域，尤其在基于计算机辅助DRP方面受到越来越多研发人员的关注。此外，目前DRP在孤儿药研发中受到的一些阻碍并不是不能克服，需要各部门联合进一步指导和支持，争取早日通过DRP策略突破孤儿药研发的瓶颈。