肿瘤外泌体标志物应用及靶向治疗进展

江佳佳，吴佩佩，许文荣

(1. 江苏大学附属澳洋医院肿瘤研究院，江苏 苏州 215600； 2. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

恶性肿瘤的早预防、早诊断和早治疗是精准医学和个体化治疗的关键。目前临床采用的肿瘤诊断指标多为血清中蛋白类分子，其特异性及敏感性均不高[1]，因此，亟须开拓早期非创伤性的诊断标志物。液体活检是一种非侵入性的血液检测突破性技术，能早期快速地检测肿瘤及其病灶或者转移过程中释放到血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和肿瘤外泌体等肿瘤组分。肿瘤外泌体作为液体活检的一个重要组成，基于其内容物成分多样和稳定等优势，正成为肿瘤标志物相关研究的热点。

肿瘤异质性、复发、转移和耐药等依然是肿瘤难治的主要原因，而以手术、化疗和放疗为主的治疗手段，由于靶向性不足、药物和放疗的毒副作用等诸多挑战，导致肿瘤的治疗效果不佳。有研究表明，肿瘤治疗不能仅针对恶性肿瘤细胞，更要考虑到肿瘤微环境的影响[2]。肿瘤来源纳米大小的外泌体具有易通过血脑屏障、天然的归巢特性、双分子层脂质结构的稳定性和高效的生物相容性等特征。因此，肿瘤外泌体正成为肿瘤靶向治疗理想的载体，尤其是工程化外泌体更表现出卓越的肿瘤靶向干预和增强药物治疗的效果(图1)。

1 肿瘤外泌体与液体活检

疾病诊断和预后监测的理想生物标志物一般具备以下特点：通过无创性操作易于获得，高度的敏感性和特异性，对疾病的早期阶段具有诊断能力，样本有较长的半衰期，检测方法快速准确等。针对CTC、ctDNA和肿瘤外泌体等成分进行检测的液体活检技术已成为转化医学研究中快速发展的领域[3]。外泌体能携带多种生物活性分子循环于血液/体液中并介导长距离的细胞间通讯，肿瘤来源外泌体富含的蛋白质、核苷酸、脂质等分子能够反映其来源细胞的生理及病理状态，外泌体特殊的脂质双分子层结构能保护其内RNA等分子免于降解，因此，检测肿瘤外泌体成为液体活检一个显著优势[4-5]。临床试验研究表明，外泌体在多种疾病的早期诊断、疗效和预后监测等方面都具备较好的应用价值，正逐渐成为临床诊疗中新的、理想的生物标志物和可能的靶向药物载体。随着技术的进步，组学时代的到来，大规模蛋白质组学已经被联合应用于筛选和揭示多种癌症细胞外囊泡的标志物[6]。

1.1 肿瘤外泌体样本的采集

在血液和大多数体液(如尿液、脑脊液、唾液、胸腹腔积液、羊水和乳汁等)中均可检测到外泌体。血液外泌体的检测通常采用EDTA抗凝血分离的血浆，miRNA等一些微小RNA则采用血清样本[7]。泌尿系统中存在大量的RNA水解酶可降解尿液中的裸miRNAs，但外泌体外膜则可帮助RNA免于被降解，因此研究尿液外泌体miRNAs更具有应用价值[8]。相较于血清中相关miRNA的水平，脑脊液外泌体中的miR-21可作为胶质瘤诊断和预后的指标，特别对预测肿瘤复发或转移具有价值[9]。唾液样本在安静状态下主要来源于舌下腺和颌下腺，刺激状态下则主要来源于腮腺[10]。

1.2 肿瘤外泌体样本的提取

目前较为常用的外泌体提取方法包括离心法(超速差速离心法、蔗糖密度梯度离心法)，磁珠分选法，微流控技术和试剂盒法提取试剂盒等。而不同提取方法获得的外泌体在产量、纯度和颗粒完整性等方面差异较大。超速差速离心法是目前较为公认的分离外泌体的经典方法，被用于细胞培养液及体液的外泌体分离，主要是基于细胞外囊泡(extracelluar vesicles，EVs)的大小、密度等，但耗时且所获得的外泌体纯度低，并可能会破坏其形态学结构[7]。蔗糖密度梯度离心法根据不同物质密度分离外泌体，所获得外泌体纯度较高，适用于外泌体形态学的鉴定，但耗时、产量低[7]。免疫磁珠捕获法通过结合单克隆抗体来捕获暴露特定配体的EVs，简单省时且分离纯度较高，可用于临床，但不适于大体积样本的分离，且所获外泌体活性受到一定影响，不利于后续功能学研究[7]。微流控技术是利用外泌体在微量体上的物理和生物化学特性来进行快速有效地分离，省时高效，但不适于大体积样本分离[11]。外泌体分离商业试剂盒主要用于尿液、血清、脑脊液和细胞培养基等无细胞样本，并提取所获外泌体RNA进行miRNA检测和表达谱分析[11]。流式细胞分选法纯度高，能特异性分选某种细胞来源的外泌体，适合后续功能学研究，同样不适于大体积样本的分选[7]。根据实验目的以及成本考虑，研究人员应根据实际情况选择最适宜的分离方法。

2 肿瘤外泌体标志物的应用

外泌体富含蛋白质、脂质和核酸分子，这些分子具有来源细胞的特异性，所以通过分析肿瘤细胞所释放的外泌体分子特征就可部分反映其来源细胞表型及其生物学作用[3,12]。

2.1 外泌体蛋白标志物

现已发现多种肿瘤外泌体来源的蛋白类分子标志物。例如，乳腺癌、结肠癌和胰腺癌中均可检测到磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC1)的表达，且与乳腺癌和结肠癌相比，GPC1对胰腺癌的早期诊断尤具价值[13-14]。前列腺癌患者血浆外泌体中凋亡抑制蛋白的表达增高则提示与肿瘤进展相关[15]。随着蛋白组学技术的发展，研究发现肿瘤患者血液外泌体来源的蛋白标志物其诊断特异性和敏感性分别可达到95%和90%[6]。

2.2 外泌体miRNA分子标志物

miRNA是肿瘤外泌体检测中较常见的标志物，到目前为止已鉴别了2 500余种miRNAs分子[16-18]。例如，血液外泌体miR-21的升高已被证实与胰腺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等多种肿瘤相关，可能与其参与肿瘤血管生成有关，研究表明肺癌细胞释放的外泌体miR-21会通过STAT3依赖机制诱导周围支气管细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的产生，从而促进血管生成[19-20]。在食管癌中，miR-21还可以反映肿瘤的恶性程度，食管癌患者的miR-21水平与良性肿瘤患者相比急剧上升，上升的miR-21水平也与肿瘤的淋巴侵袭和转移相关[21]。在膀胱癌患者中，尿液中的miR-21和miR-4454会显著上调[18]。前列腺癌患者尿液外泌体中的miR-574-3p、miR-141-5p和miR-21-5p的表达水平显著上升，表明这些miRNAs可用于前列腺癌的早期筛查[22]。胆管癌是恶性程度较高的消化系统肿瘤，发展隐蔽且临床症状及体征出现晚，故给早期诊断带来困难。高通量小RNA测序筛查了来自胆管癌和胆囊癌患者外泌体中一系列差异表达的miRNA，小RNA长度在正常个体、胆管癌患者和胆囊癌患者之间的分布存在显著差异，胆管癌患者的外泌体中miR-96-5p、miR-151a-5p、miR-191-5p、miR-4732-3p显著升高，而胆囊癌患者的外泌体中miR-151a-5p略有升高，为胆管癌和胆囊癌提供了一套新的生物诊断标志物[23]。

2.3 外泌体长链非编码RNA分子标志物

当前，应用于胃癌诊断的血清生物标志物包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌抗原72-4(CA72-4)和CA19-9，然而这些分子的特异性和敏感性均较低[1]。因此，开发具有高特异性和敏感性的诊断早期胃癌的新方法至关重要[24]。胃癌相关的长链非编码RNA1(lncRNA-GC1)在胃癌发生中起重要作用，但是外泌体lncRNA-GC1及其在胃癌中的潜在作用此前研究较少。研究证实，循环外泌体lncRNA-GC1具有作为早期检测和监测胃癌进展的重要诊断价值，可作为无创生物标志物用于早期诊断和监测胃癌进展[25]。上述研究表明，肿瘤外泌体内的lncRNA分子在一些肿瘤相关疾病中同样具有重要的诊断应用价值。

2.4 外泌体circRNA分子标志物

近年来，circRNA分子因独特的环状结构具备更稳定的生物学特性而备受关注。如circZKSCAN1在肝癌细胞中低表达且抑制肝癌细胞的增殖[26]，ciRS-7则被认为是非小细胞肺癌、结肠癌和胃癌等肿瘤的预后指标，其高表达与较高的临床分期和较差的总体生存期相关[27]。目前已发现组织、血液和外泌体中的circRNA分子表达失调，而多种circRNA的联合检测会提高外泌体标志物的敏感性和特异性，甚至可达到90%左右[4,28]。

3 肿瘤外泌体与靶向治疗

外泌体可作为纳米载体来介导细胞间的信息传递，发挥信息传递作用的方式主要有：在细胞间转移受体，通过配体-受体介导的方式作用于受体细胞，向受体细胞转移功能蛋白，通过膜融合方式向受体细胞传递mRNA、miRNAs或转录因子等信息[29-32]。这些方式为肿瘤靶向治疗开辟了新的途径。例如，miRNA-130b-3p可通过p53信号通路靶向丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(SIK1)抑制髓母细胞瘤生长[16]。

外泌体广泛分布于不同体液中，在体内有较长的半衰期，可利用电穿孔法、化学转染法或共孵育等方式把治疗性药物装载到外泌体中或将编码某蛋白质的基因转入到分泌外泌体的细胞中[33]。例如，合成的miR159可通过靶向编码Wnt信号转录因子的转录因子7(TCF7)基因抑制乳腺癌细胞增殖，导致致癌蛋白MYC水平下降，异体移植乳腺肿瘤的动物模型也显示口服植物源性miR159可显著抑制肿瘤生长[34]。肿瘤细胞衍生的微粒(tumor derived microparticles，TMPs)可以用作化疗药物的载体，同时可作为免疫调节剂发挥抗肿瘤治疗效应。近期，一项临床研究显示，肿瘤细胞衍生的含甲氨蝶呤的TMPs能够有效缓解胆管癌患者发生胆道梗阻的症状[35]。综上表明，天然或者工程化修饰的外泌体或可用于治疗难治性肿瘤。

4 肿瘤外泌体与耐药

现有研究发现多种外泌体来源的circRNA分子可能与肿瘤耐药性相关，如has_circ_0004015高表达与酪氨酸激酶抑制剂耐药相关，该分子可能通过与miR-1183结合靶向磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1)基因，从而导致非小细胞肺癌对吉非替尼耐药；circAKT3的高表达与胃癌对顺铂耐药相关[36]。单细胞RNA测序确定了一种新的与癌症相关的成纤维细胞(cancer associated fibroblast，CAF)亚群CD63+CAFs，分泌富含miR-22的外泌体，miR-22可以结合其靶标雌激素受体α(ERα)和磷脂酶及张力蛋白同源物(PTEN)，从而促进乳腺癌细胞他莫昔芬抗性，使ERα阳性的乳腺癌患者对他莫昔芬产生耐药性并伴有转移复发[37]。CAFs的EVs蛋白质组学分析确定了膜联蛋白A6的重要作用，其通过激活β1整联蛋白-局灶性黏附激酶(FAK)-YAP信号从而诱导细胞外基质中胃癌细胞网络的形成和耐药的发生。这些发现表明，耐药性是由CAFs的EVs中的膜联蛋白A6赋予，并通过结合常规化学疗法抑制FAK-YAP信号传导，这为抑制胃癌耐药性提供了潜在途径[38]。

5 肿瘤外泌体与肿瘤发生、发展

肿瘤细胞来源的外泌体可抑制T细胞诱导细胞凋亡，或抑制NK细胞促进肿瘤免疫[39-40]；能抑制抗原递呈细胞的分化和成熟，从而抑制免疫反应[41]；可促进髓系抑制性细胞抑制免疫应答[42]；通过抑制T细胞增殖诱导调节性T细胞分化以协助肿瘤逃逸免疫监视，最终促进肿瘤的发生[43]。肿瘤相关巨噬细胞通过EVs传递缺氧诱导因子1α(HIF-1α)稳定的lncRNA，增强乳腺癌细胞的有氧糖酵解和细胞凋亡抗性，从而调控肿瘤细胞的代谢重编程[44]。另一项研究显示，外泌体内circSHKBP1可通过调节miR-582-3p/HUR/VEGF途径，抑制HSP90降解，促进胃癌进展，是探索进一步治疗的绝佳候选者[45]。

研究还发现外泌体可促进血管生成，如心肌内皮细胞来源的外泌体能够诱导细胞增殖及血管生成；黑色素瘤细胞来源的外泌体中miR-9通过抑制细胞因子信号转导抑制因子5(SOCS5)的表达激活了JAK-STAT信号通路，从而促进内皮细胞的迁移和血管生成[46]。此外，肿瘤细胞来源的外泌体能促进肿瘤的转移，还可转运具有侵袭潜能的miRNA[47]，也可通过促进肿瘤细胞的上皮细胞间充质转化来增强肿瘤的转移性进展[12]。例如，外泌体可释放转化生长因子β(TGF-β)激活TGF-β信号通路，使成纤维细胞转变为成肌纤维细胞，从而促进肿瘤的转移[48]。除了细胞来源外泌体对肿瘤的影响外，细菌也是影响肿瘤发生发展的重要因素。最新研究显示，具核梭杆菌是一种重要的结直肠癌相关细菌，感染该菌后可刺激结直肠癌细胞生成富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8的外泌体并递送至未感染的细胞，促进肿瘤转移[49]。

6 结语

由于外泌体分离方法存在差异化，检测方法缺乏标准化以及样本来源不一致等因素，研究报道的外泌体标志物检测结果差异较大，常有矛盾之处[50]。因此，提高外泌体分离的提取效率是外泌体临床转化应用过程中值得关注和解决的首要问题。蛋白组学分析结果表明，血液外泌体中蛋白类标志物具备成为早期诊断标志物和鉴别原发性肿瘤的潜力[6]，外泌体中miRNA和circRNA分子的研究则为临床建立特异性检测Panel提供了依据。

外泌体传递细胞间遗传信息的机制是引起肿瘤异质性的重要因素之一[51]。在肿瘤异质性环境中，外泌体可促进肿瘤的进展[52]，也可能通过信号传导在治疗方面产生肿瘤异质性[53]。此外，不同细胞生成的外泌体也存在异质性，Baietti等[54]发现沉默液泡分选蛋白4(VPS4)基因和肿瘤易感基因101蛋白(TSG-101)基因均可抑制乳腺癌MCF7细胞产生外泌体。因此，在选择外泌体作为肿瘤诊断与预后监测的分子标志物时应考虑到肿瘤异质性的发生机制。

外泌体是机体来源的自然成分，能在体内稳定存在，经过特定修饰后具有靶向性，但也需关注外泌体的靶向性与耐药性的关系。目前，天然或者工程化修饰的外泌体被视为一种理想工具用于治疗一些难治性肿瘤。因此，外泌体在靶向治疗中的应用前景值得期待和进一步挖掘。