急性髓系白血病DNA异常甲基化及治疗进展

冯秀娟， 吴 涛， 白 海

（中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院全军血液病中心，甘肃 兰州730050）

急性髓系白血病（acute myeloid leukaemia，AML）是一组造血细胞异常增殖和分化抑制造成的恶性克隆性血液疾病，具有明显异质性，有单个或多个分子遗传学事件参与其发病[1]。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）根据白血病患者临床特点及形态学（morphology,M）、细胞免疫学（immunology,I）、细胞遗传学（cytogenetic,C）、分子生物学（molecular biology,M）异常制定了MICM分型，指导临床对白血病的诊断分型、个体治疗和预后判断。随着现今医学的发展及患者的期望值升高，对白血病的治疗方案愈来愈趋向于个体化、精准化、靶向化。DNA甲基化作为AML表观遗传学调控的常见模式，对其研究促进了近年来DNA甲基化治疗药物的发展，给AML的靶向治疗提供更多选择。

DNA甲基化在AML中的致病机制

DNA甲基化过程广泛存在于哺乳动物细胞内，在表观遗传修饰和染色质稳定性中起关键作用。有研究发现DNA甲基化能够关闭某些基因的活性，导致染色质结构、DNA构象以及DNA与蛋白质的相互作用方式发生变化，进而调控基因的表达。而近年针对表观遗传学中DNA甲基化的研究发现，DNA的异常甲基化与肿瘤的发生关系密切，其主要致癌机制为，抑癌基因启动子区被异常甲基化致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤的发生[2]。大量关于AML的研究中发现，异常的DNA甲基化水平是AML显著的病理特征。另有部分专家认为DNA异常甲基化参与影响骨髓分化，是造成白血病的又一发生机制[3-4]。

DNA甲基化的生物学特点

DNA甲基化由DNA甲基化酶（DNA methyltransferase，DNMT）介导，DNMT维持细胞内DNA甲基化正常进行，将甲基化标签从亲代链复制到子代链[5-6]。DNMT以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基来源，将DNA中胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，从而转变为5-甲基胞嘧啶 （5-methylcytosine,5-mC），这些甲基化基因序列可有效抑制DNA的转录，导致相关基因表达缺失，进而导致疾病发生。在哺乳动物基因组中，DNA甲基化的主要位点是CpG二核苷酸，其在基因组中呈不均匀分布。在某些区域，CpG序列的密度较平均密度高10～20倍，这些区域被称为CpG岛，常位于基因上游调控区的启动子区。在启动子区的CpG岛通常处于非甲基化状态，使基因正常表达。CpG岛区域的胞嘧啶异常甲基化可影响基因转录调控，导致肿瘤抑制基因突变和缺失，负调控因子缺失或者失活，使正常基因表达沉寂，最终导致机体肿瘤发生。

DNA甲基化在AML中的修饰作用

AML DNA甲基化异常包括低甲基化和高甲基化，低甲基化可致染色体不稳定，使基因异常活化，如AML患者中DNMT3A基因的缺失和突变将导致AML肿瘤细胞基因组DNA总甲基化水平降低，促使癌基因活化，患者预后不良。与大多数基因组相比，高甲基化则常发生在基因启动子区域，导致基因沉默，如血液恶性肿瘤中抑癌基因高甲基化则导致肿瘤发生、发展[7-8]。

AML患者中常见DNA甲基化的相关基因

AML中常见的甲基化调节蛋白包括DNMT3A、10-11易位癌基因家族成员2（ten-eleven translocation 2，TET2）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）1/2。DNMT3A催化CpG核苷酸残端胞嘧啶甲基化，TET2则催化甲基化的5-mC羟基化形成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）达到去甲基化。IDH1/2催化异柠檬酸盐氧化脱羧作用产生α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG），而α-KG是TET2羟化反应必需的底物。一旦这些调节蛋白基因突变就会造成DNA异常甲基化。

一、DNMT3A

DNMT3A编码的DNMT参与从头甲基化，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合1个甲基基团，能阻断转录因子复合物与DNA的结合，从而抑制基因表达，参与细胞的生长、分化、调控。研究发现DNMT3A基因沉默可导致造血干细胞增殖和分化功能受损，故当造血干细胞携带DNMT3A突变时，可表现为白血病前期阶段，当机体伴发其他突变时可进展为AML。所以DNMT3A基因也被大多数研究认为是驱动基因[9]。Jones等[10]研究发现DNMT3A基因缺失和突变可导致肿瘤细胞基因组DNA总甲基化水平降低，促使癌基因活化。临床上伴该突变AML患者的生存期缩短，复发风险增加，常提示预后不良。此外，DNMT3A突变在疾病演变过程中稳定，可以成为检测白血病微小残留病（minimal residual disease，MRD）的分子标志物。

二、TET2

TET2编码TET2蛋白，是生物体内存在的α-KG和Fe2+依赖的双加氧酶，该蛋白可以催化5-mC转化为5-hmC，是DNA去甲基化过程中的一种重要酶，能阻止干细胞、祖细胞的不可控生长，进而阻止肿瘤形成。TET2突变使TET2蛋白功能丢失，从而导致造血干细胞异常增殖及分化。目前TET2突变与AML患者预后尚无共识性结论，其在疾病进展过程中表现不稳定，在复发时经常丢失，故不能作为监测MRD的稳定指标。

三、IDH1/2

IDH基因突变通过使组蛋白和DNA的甲基化来降低相关分化调节基因的表达，导致造血细胞分化受阻和恶性克隆的形成，引起AML发生、发展。AML中IDH突变亚型常见的有IDH1、IDH2。罗丽卿等[11]研究发现IDH基因突变更多见于正常核型的AML患者，常伴发核仁磷蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）基因突变，与疗效密切相关，是提示预后不良的分子标志物。IDH1、IDH2突变在疾病演变过程中高度稳定，可考虑作为监测MRD的潜在分子标志物。

DNA异常甲基化对AML患者预后的影响

基因启动子的高甲基化状态是影响AML患者预后的重要风险因素[2,6,8-9]。CpG岛甲基化状态影响蒽环类药物的敏感性，故纠正表观遗传学异常可以逆转复发特异性基因表达谱，恢复化疗药物敏感性，产生更强的细胞毒作用。另DNA甲基化对AML的预后与受影响的基因有关，如抑癌基因乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer 1，DBC1）参与细胞周期调控，但有研究显示DBC1基因CpG岛甲基化的染色体核型正常的AML患者10年生存率明显低于非甲基化患者[7]。CCAAT/增 强 子 结 合 蛋 白α（CCAAT/enhancer binding protein,C/EBPα）双突变是预后良好的标志，超过70%可长期生存，而DNA甲基化导致该基因静默的AML患者近80%会复发。且患者常发生DNA甲基化的相关基因均提示预后不良，表示DNA异常甲基化与AML患者的预后明确相关，且目前相关研究多提示预后不良。

DNA甲基化在AML治疗中的进展

目前临床上针对研究DNA甲基化的药物有：去甲基化治疗药物如地西他滨及阿扎胞苷（azacitidine,AZA）；蒽环类化疗药物如多柔比星、伊达比星；降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）甲基化的药物如西罗莫司等。虽然目前对该类药物应用较为广泛，但其合理用药方面仍存在一些问题亟待解决。

一、去DNA甲基化

目前去DNA甲基化药物主要为DNMT抑制剂，可分为核苷类和非核苷类2类，核苷类去甲基化药物中的AZA和地西他滨是目前获准应用于临床较广泛的去甲基化药物。DNA高甲基化导致抑癌基因不表达从而导致细胞分化功能受抑制是AML重要的发生机制[12]，AZA和地西他滨通过抑制DNMT1使DNA去甲基化，借助逆转甲基化过程，重新激活抑癌基因发挥治疗血液肿瘤效果。临床上主要用于原始细胞20%～30%的AML或原始细胞＞30%但无法耐受常规化疗的老年患者[7]。

1.地西他滨：地西他滨（5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷）作为脱氧核苷酸类似物，其中的5-氮杂胞嘧啶部分可代替胞嘧啶，被掺入DNA链中（5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷是一种天然2’-脱氧胞苷酸的腺苷类似物，可直接作用于DNA）。氮杂胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷片段DNMT识别为天然的底物，5-氮杂胞嘧啶的第5位氮原子被甲基化。正常的胞嘧啶第5位是碳原子，甲基化修饰后可通过C-5位的β消除来使DNA与甲基化酶解离；而5-氮杂胞嘧啶的5位氮原子被甲基化后，不能发生上述β消除，使DNMT保持与DNA的共价结合，从而抑制该酶的功能，使DNA低甲基化[13]。有研究表明低浓度的甲基化抑制剂可促进造血干细胞增殖，高浓度则抑制其增殖[14-15]。后通过临床用药亦证实地西他滨高剂量用药与化疗药物的细胞毒性类似，骨髓抑制作用较明显，低剂量用药则主要实现去甲基化的作用，使肿瘤细胞DNA甲基化降低，重新激活抑癌基因，控制肿瘤细胞增殖[16]，从而治疗白血病。

有研究应用地西他滨20 mg/（m2·d）×5 d标准足剂量单药治疗高危骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和AML患者各10例，老年患者总有效率达77.8%，完全缓解（complete response，CR）率33.3%[17]，高于国内外相关研究报道[18-19]；其中70岁以上老年患者占CR患者的83.3%，表明高龄老年患者对地西他滨的治疗可能更为敏感，具体机制待进一步研究明确。此项研究在对比诊断、性别、美国东 部 肿 瘤 协 作 组 （Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分、白细胞计数、是否高危、是否合并基础疾病及地西他滨治疗疗程是否≥3个等影响地西他滨疗效因素的分析中，发现治疗疗程是否≥3个是地西他滨治疗后能否达CR的影响因素（P＜0.05）。在接受3～26个疗程的12例患者中，6例（50.0%）获得CR，4例为AML患者，1例持续地西他滨治疗26个疗程但从未缓解的AML患者稳定生存了26个月。MD安德森癌症中心的一项Ⅲ期临床对照研究显示，地西他滨临床CR率优于常规支持治疗和小剂量AZA，中位生存期未获显著延长，分别为7.7个月和5个月（P＝0.108）[20]。Blum等[21]将地西他滨剂量增至20 mg/（m2·d），共10 d，在接受中位3个疗程治疗后，总有效率为64%，其中47%患者达到CR，总生存（overal survival，OS）期和无进展生存（progress free survival，PFS）期分别为55周和46周。表明应延长地西他滨治疗周期，以确保机体有足够的机会作出反应，原因可能为低浓度时地西他滨的去甲基化作用可重新激活抑癌基因，控制肿瘤细胞增殖，使肿瘤细胞分化、凋亡。而只有通过不断持续地去甲基化治疗，才能达到最大缓解。即使未达血液学缓解，持续的去甲基化治疗也可改善患者症状，延缓疾病进展，国内外相关研究的结论一致[17,22-24]。另有报道显示，地西他滨可有效提高DNMT3A突变相关AML患者的CR率及OS率[13,16]。

2.AZA：AZA亦称5-氮杂胞苷，是一种胞嘧啶核苷类药物，使5-氮杂胞嘧啶的第5位氮原子代替正常的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，从而阻止DNA的过度甲基化，作用机制基本同地西他滨。Sockel等[25]报道10例出现分子学复发的AML患者，中位应用5个周期AZA进行干预，随访10个月，7例患者出现MRD下降，并维持CR。MD安德森癌症中心的Ⅲ期临床对照研究中，AZA较常规支持治疗组的CR率虽未明显增加，但OS期明显延长[20]。2010年的一项多中心、随机、对照、开放性Ⅲ期临床试验（AZA-001研究）结果显示，相对传统治疗，AZA对高风险的MDS患者疗效更好，中位OS期更长（P＜0.000 1）[26]。据此数据，2008年欧洲联盟批准AZA用于治疗MDS和骨髓原始细胞比例＜30%的AML患者。2015年公布的一项随机、开放性Ⅲ期临床试验研究（AZA-AML-001）显示，对年龄≥65岁且骨髓原始细胞比例＞30%的新发AML患者，与传统支持治疗相比，AZA治疗组显著提高患者的1年生存率（34.2%比46.5%），且未达到CR的患者中位OS期自4.2个月延长至6.9个月（P＝0.017 0）[27]。2016年欧洲联盟批准AZA可治疗骨髓原始细胞任何比例的老年AML患者。此后Pleyer等[28]选取与AZA-AML-001研究标准相同的407例新发AML患者进行比较，发现两队列中AZA治疗患者的中位OS期分别为10.8个月和9.9个月，同时还比较了407例新发AML患者中符合AZA-AML-001研究纳入标准与符合WHO的AML诊断标准的患者数据，结果发现这两队列患者的中位OS期分别为10.8个月和11.8个月。由此得出AZA作为一线用药在实际临床中治疗骨髓原始细胞比例＞30%、白细胞计数≤15×109/L的AML患者有效，治疗符合WHO AML诊断标准的患者亦有效。目前国内外研究均显示AZA在治疗AML患者中疗效显著，尤其对化疗药物耐受性较差的老年患者，且AZA对高风险MDS或复发AML患者，在异基因造血干细胞移植后再以AZA进行巩固性治疗可显著减少或延缓疾病复发，延长患者 的OS期[29-30]。

有研究用小剂量地西他滨治疗MDS患者，结果显示患者生活质量得到改善，延迟向白血病转化，但对OS率无影响[31]。Welch等[32]使用20 mg/（m2·d）×10 d或5 d地西他滨治疗116例具有不良遗传学异常和分子学异常的AML或MDS患者，结果其缓解率高于低中71例AML/MDS患者。对去甲基化药物治疗AML/MDS的荟萃研究显示，与常规治疗方案相比，去甲基化药物可以增加OS率（33.3%比21.4%）和总有效率（23.7%比13.4%），但进一步亚组分析显示AZA组OS率改善，而地西他滨组OS率无改善。因此，AZA是目前唯一临床证实改善AML/MDS患者OS的去甲基化药物[33]。

二、降低mTOR

mTOR参与细胞周期调控的多个步骤，是调节细胞生长的关键蛋白，mTOR被异常激活后会促使癌细胞的高速分化，而当西罗莫司与mTOR结合，其活性被抑制后能使细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞异常增殖与分化。近年的研究证明，mTOR是抗癌、免疫抑制和抗衰老治疗的重要靶点。石晓东等[34]在小鼠体内研究发现DNMT3A可致mTOR的甲基化降低，而基因表达上调，上调的mTOR可进一步调控下游基因引发白血病。预示mTOR可作为含有该类突变的AML潜在治疗靶点。后通过检测用西罗莫司处理前后有DNMT3A突变及无DNMT3A突变的AML患者原始肿瘤细胞的增殖及凋亡情况，证明了西罗莫司可通过靶向异常的mTOR基因发挥有效抑制DNMT3A突变原始肿瘤细胞的增殖并引起白血病细胞凋亡的作用，为临床试验用药提供了参考证据[35]。

三、蒽环类化疗药物

蒽环类药物是AML诱导缓解的基本药物，临床常用的如多柔比星、伊达比星、米托蒽醌（属蒽醌类衍生物）。蒽环类化疗药物虽具有广谱抗瘤性，抗瘤作用强，疗效确切，但其不良反应亦较明显。有研究表明通过使用比常规化疗药物更高剂量的蒽环类药物，虽在一定程度上可改善患者预后，延长患者生存期，但也同时增加不良反应及耐药性。故研究作用于DNA甲基化靶点的药物，减少药物对身体各器官的不良反应对治疗AML非常重要[7]。

目前，临床上去甲基化药物治疗AML疗效不理想，主要与不规范使用有关。首先，DNA甲基化过程可逆，去甲基化药物不能去除白血病干细胞，当获得疗效后应持续应用，停止使用疾病就会复发。其次，去甲基化药物缺乏基因特异性，任何基因甲基化都可能受到影响，治疗过程中可能造成某些癌基因或抑癌基因异常活化或静默，导致难治耐药白血病发生。所以在去甲基化药物治疗前明确患者的甲基化状态显得尤为重要[7]。而在对包括DNMT3A基因在内的诸多基因启动子区甲基化状态进行检测，可利用分子生物学手段为个体化治疗和靶向治疗提供理论基础。