矿泉水中铜绿假单胞菌检测技术水平考核

李 特

（眉县食品安全检验检测中心，陕西宝鸡 722300）

铜绿假单胞菌原称绿脓杆菌，在自然界分布十分广泛，其喜好较湿润的环境，为土壤中存在的最常见的细菌之一。水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。铜绿假单胞菌为条件致病菌，一般条件下不会感染人，但如果人的防御机制被破坏，抵抗力降低，如皮肤黏膜破损、使用激素或抗生素的患者等易被感染。因此，铜绿假单胞菌超标对抵抗力较弱的人群存在较大的感染风险，如抵抗力差的老人和小孩，易引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。

1 .材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 菌株和样品

检验及计数过程中以铜绿假单胞菌标准菌株（ATCC 27853）作为阳性对照菌株，以荧光假单胞菌标准菌株（ATCC 13525）作为阴性对照菌株。质控样冻干粉安瓿瓶1瓶。

1.1.2 仪器设备

智能恒温恒湿箱HWS-150A（杭州大材光电科技有限公司）；多联过滤系统MFS-6A-250-K（广东环凯微生物科技有限公司）；净化工作台SW-CJ-1FD（苏州同盛）；生物安全柜BSC-1300IIA2（苏净安泰）；高压蒸汽灭菌器MLS-3751L-PC（日本松下）；立式压力蒸汽灭菌器LDZM-80KCS-Ⅱ（上海申安医疗器械厂）；紫外检测灯BD-AA 366 nm（北京启航博达科技有限公司）。

1.1.3 培养基和试剂

假单胞菌琼脂基础培养基（CN平板）、营养琼脂、绿脓菌素测定培养基、金氏B培养基、乙酰胺肉汤，以上培养基均由北京陆桥股份有限公司生产；氧化酶试纸（广东环凯）；无菌水及0.85%生理盐水为实验室自备。

1.1.4 实验物品

一次性使用滤杯；一次性使用培养皿；直径47 mm，微孔径为0.45 μm的无菌滤膜；100 mL三角瓶；镊子；移液管。

1.2 方法

按照质控样说明书对冻干粉进行水化，然后10倍递增稀释，依据《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）采用滤膜法检验[1]。

1.2.1 样品溶解

用75%酒精棉擦拭西林瓶外表面，开启西林瓶，立即（1 min内）加入少量（2～4 mL）稀释液（0.85%生理盐水）进行再水化，待溶解后，将其置于无菌三角瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液于上述无菌三角瓶中，稀释液总计40 mL。用移液管取10 mL加入到240 mL无菌生理盐水中，该溶液即是待测样品原液（即100）[2]。

1.2.2 样品稀释

分别取25 mL上述制备的待测样品原液加入到225 mL无菌生理盐水中（也可取50 mL上述制备的待测原液加到450 mL无菌生理盐水中），制成1∶10样品匀液，以此类推制备10倍系列稀释样品匀液，在100～1056个稀释度按照标准方法进行后续操作（要求做平行样）。

1.2.3 样品过滤

过滤前，提前启动超净工作台风机，用火焰喷枪对滤芯进行灭菌，待冷却后，先用无菌镊子夹取无菌滤膜边缘部分将格栅面向上贴放在已灭菌的滤芯上，固定好滤杯，倒入250 mL样液，启动真空泵抽滤至净干，待管里无水流动时，关闭真空泵，取下滤杯，将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺，格栅面向上，滤膜和CN平板之间不能有气泡，如有气泡可用镊子夹着滤膜边缘将滤膜提起排净气泡[3-4]。

1.2.4 培养

将CN平板放入36 ℃培养箱，倒置培养24～48 h。在培养20～24 h和40～48 h后分别观察滤膜上菌落的生长情况并计数。

2 结果报告

培养40 h左右CN平板上有4种菌落形态，分别为蓝色菌落、红褐色菌落、366 nm紫外灯下产荧光（非蓝/绿色菌落）菌落及黄色菌落。按照GB 8538—2016中57.5.4步骤对前3种可疑菌落分别进行确证性实验。验证结果为蓝色菌落绿脓菌素实验阳性，红褐色菌落氧化酶、产氨及产荧光实验均为阳性，产荧光（非蓝/绿色菌落）菌落产氨实验阴性。根据蓝色菌落的计数和确证性实验的结果，计算每250 mL水样中的铜绿假单胞菌数量。结果8.0×103CFU/250 mL，Z值为0.44，结果满意。

3 结论

本次盲样考核结果为满意。考核前从人、机、料、法、环5个方面做好充足的准备。检验人员要熟悉标准、作业指导书及操作过程，思路清晰、实验方案明确、实验严瑾。通过此次考核也证明了实验室满足铜绿假单胞菌的检测能力。

4 注意事项

①实验前准备。实验前准备好实验所需物品，如滤杯、滤膜、镊子、移液管、三角瓶和盐水等，准备足够的CN平板，确保实验所需的培养基、试剂充分且在有效期内。认真研读理解作业指导书，提前想好实验方案。②微生物质控样应放在-18 ℃冰箱中保存。使用时，从冰箱中取出待样品达到室温方可开启使用。③移取操作准确。西林瓶中的液体可用一次性使用无菌注射器吸入三角瓶中，避免样液损失。④放进培养箱后再次确认培养温度是否符合标准要求，培养24 h后即可先观察计数，避免有的细菌生长过快、过大覆盖其他细菌影响计数，继续培养至48 h左右再次计数，综合2次的计数确定最终的可疑菌落数。⑤实验结束后所有与实验相关的物品均需按实验废弃物处理方法121 ℃高压灭菌至少30 min后，装入特殊标志的垃圾袋内，送到指定地点[5]。