一例奶牛乳房炎病例病原菌分离及鉴定

宋淑英

（辽宁省动物疫病预防控制中心，沈阳 110164）

奶牛乳房炎是奶牛养殖过程中的常发疾病之一，临床表现为乳房肿胀、炎症区域温度升高、乳区泌乳障碍、分泌乳汁呈血乳及浑浊。该病发展至后期可导致奶牛死亡，给奶牛养殖业造成巨大经济损失［1-3］。病原菌微生物感染是造成奶牛乳房炎的主要原因，目前已知有超过180 种病原微生物能够引起奶牛乳房炎［4，5］。本研究对辽宁抚顺某奶牛养殖场1例乳房炎阳性病例进行病原菌分离、鉴定，为该场确定乳房炎病因、制定合理的治疗及防控措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病例情况 乳房炎阳性病牛临床表现为2 个乳区明显肿胀、泌乳机能障碍、疼痛感较为明显、泌乳为血乳并伴有乳汁凝块，乳区温度高。

1.1.2 试验仪器 10 mL 离心管、培养皿、酒精灯、各量程微量移液器（Eppendorf）、恒温隔水式培养箱（SDK-9685）、无菌洁净工作台（SJ-6093）、玻璃棒等均由抚顺市动物疫病预防控制中心提供。

1.1.3 主要试剂 营养肉汤（NB）培养基、普通固体琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；甘露醇氯化钠培养基、改良爱德华培养基，青岛海博生物技术有限公司；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管、葡萄球菌属细菌生化鉴定管，杭州微生物试剂有限公司；链球菌细菌生化编码鉴定管，杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 将病牛隔离保定，使用乙醇、碘酊对患病乳区进行3 次消毒。弃去头3 把奶后，挤5～8 mL 乳样于灭菌的离心管中。将离心管密封标记后，于4 ℃冰盒内尽快送至实验室进行病原分离。

1.2.2 培养基制备 分别取适量的麦康凯琼脂粉、甘露醇氯化钠琼脂粉和改良爱德华琼脂粉，溶于1 000 mL去离子水中，高压灭菌后制备固体培养基。制备改良爱德华培养基时，需在液体培养基温度达到39～45 ℃时快速加入5 mL 5%脱纤维兔血，并迅速摇匀［6］。上述固体培养基需在洁净工作台中制作且需满足一定厚度。培养基制作完成后，倒置于37 ℃恒温培养箱中过夜检菌。检菌合格的培养基可用于病原分离试验。

1.2.3 病原菌初步分离 用微量移液器取病料乳样100 μL，注入3 mL 的无菌肉汤培养基中，于37 ℃、180 r/min 恒温培养箱振荡过夜，使病原菌整体扩增。分别取100 μL 扩增后的培养液，均匀涂布于检菌合格的麦康凯平板、甘露醇氯化钠平板以及改良爱德华平板，用三角玻璃棒将菌液涂抹均匀，于无菌工作台中正置3～5 min，待菌液完全吸收后将其倒置于37 ℃恒温培养箱中，培养8～12 h 后观察［7，8］。将疑似分离株于固体琼脂平板中进行单独菌落分离，并保存于30%甘油中，-80 ℃保存备用。

1.2.4 病原菌生化反应鉴定 在洁净工作台对初步分离的大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌疑似分离株进行生化反应鉴定。将初步分离的病原菌分离株甘油溶液进行复苏，在肉汤扩增后进行琼脂平板涂布。在无菌工作台中，将微量生化反应管于上端1/3处掰断，反应液面与反应管断端预留出足够空间。用无菌接种针将琼脂平板中的单独菌落分别接种于对应的生化反应鉴定管中。将鉴定管封口编号后，于37 ℃恒温培养箱中过夜培养。之后观察反应管颜色变化并根据编码手册进行编码，最终确定分离株种类。

2 结果与分析

2.1 病原菌初步分离结果

病料经初步分离，麦康凯琼脂平板中选取的圆形、金属红色光泽菌落被判定为大肠杆菌疑似株，甘露醇氯化钠琼脂平板中选取的黄色菌落且菌落周围为黄色被判定为葡萄球菌疑似株，5%脱纤维兔血改良爱德华琼脂平板中选取的具有β溶血环的乳白色针尖状小菌落被判定为链球菌疑似株。结果发现，在2个患病乳区采集到的乳样中，共初步分离到7 株大肠杆菌疑似分离株、13 株葡萄球菌疑似分离株及5株链球菌疑似分离株。

2.2 病原菌生化反应鉴定结果

对初步分离的疑似菌株分别进行相应的生化反应管鉴定，观察记录结果并根据颜色反应与相应的编码手册进行赋码对比最终确定病原菌种类。结果表明，7株疑似大肠杆菌分离株中5株为大肠杆菌、2株未定型；13株葡萄球菌疑似分离株中，5株为金黄色葡萄球菌、2 株为表皮葡萄球菌、4 株为腐生葡萄球菌、2 株未定型；5 株疑似链球菌分离株中，1株为乳房炎链球菌、1 株为停乳链球菌、2 株为无乳链球菌、1株未定型。

3 小结与讨论

奶牛乳房炎发病率高、流行范围广，是制约乳产业和畜牧养殖业发展的重要疾病之一。其发病原因众多，饲养管理、营养水平、遗传品种等出现问题均可造成该病发生。病原菌感染是其最主要的发病原因之一，细菌、病毒、霉形体、支原体等超过180种病原微生物均能够引起奶牛乳房炎［9］。

引起奶牛乳房炎的众多病原微生物中，细菌是最为常见也是分离率最高的病原微生物，其中以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌为主。本研究对抚顺某牛场1例奶牛乳房炎阳性病例进行病原菌分离、鉴定，最终确定5株大肠杆菌、5株金黄色葡萄球菌、4 株腐生葡萄球菌、2 株表皮葡萄球菌、2 株无乳链球菌、1 株停乳链球菌及1 株乳房炎链球菌，这7种病原菌的分离率分别为25.0%、25.0%、20.0%、10.0%、10.0%、5.0%、5.0%。

不同地区、不同饲养条件下病原的组成不尽相同。孜来古丽等［2］报道新疆地区奶牛乳房炎主要是由无乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌共同感染造成。陈婷婷等［3］报道甘肃部分地区奶牛乳房炎主要病原菌为金黄色葡萄球菌，其分离率为39.3%。胡海燕等［4］报道天津某奶牛饲养场奶牛乳房炎主要致病菌为芽孢杆菌，其占比高达67.28%，其次为肠杆菌属；张艳等［5］对黑龙江地区进行乳房炎致病菌调查发现，其主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、蜡样芽胞杆菌，其分离率分别为26.8%、13.5%、7.2%、3.3%。朱宁等［6］报道上海地区奶牛乳房炎主要病原分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌及粪肠球菌，其分离率分别为16.9%、15.5%、11.3%、7.0%。王浩先等［7］报道安达地区奶牛乳房炎病原菌金黄色葡萄球菌分离率约为20.0%。李傲寒等［8］报道在新疆某规模化奶牛养殖场中，乳房炎病原菌组成主要为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，其分离率分别为32%、2%；张博熙等［9］对黑龙江地区奶牛养殖场调查结果表明，该地区奶牛乳房炎主要病原菌为无乳链球菌、停乳链球菌、肠球菌及少量的金黄色葡萄球菌，其分离率分别为33.5%、27.1%、10.3%及2.3%；夏颖等［10］对河北地区奶牛乳房炎调查发现，金黄色葡萄球菌和无乳链球菌混合感染为28.7%、金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染为14%、无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染为11.3%。吴利军等［11］对湖北地区奶牛乳房炎病原菌调查发现，葡萄球菌、中型无绿藻、鲁氏不动杆菌、大肠杆菌和停乳链球菌的感染率分别为35.0%、13.5%、11.9%、5.1%、2.9%。

本试验结果与上述报道中的数据相比，在病原菌种类、优势菌株占比等均存在差异，这可能与饲养环境及地理位置有关。由于不同地区主要流行菌株不同，造成各个地区乳房炎致病菌组成出现差异，因此饲养管理和治疗方案也会不同。本研究鉴定结果可为该厂奶牛乳房炎治疗方案合理制定提供参考。