湖北地区0-12岁儿童血清抗缪勒管激素参考区间的建立*

王 进 陈梦祎 龚 硕 胡晞江, #

抗缪勒管激素(Anti-Müllerian Hormone，AMH)是转化生长因子β超家族中的一种二聚体糖蛋白，由睾丸未成熟支持细胞和卵巢窦前卵泡与小窦卵泡的颗粒细胞分泌[1]。作为与两性发育密切相关的生殖激素，AMH具有辅助区分两性畸形患儿的性别、辅助诊断儿童中枢性性早熟、协助早期诊断青春期延迟和性腺功能减退症、评估肿瘤患儿化疗后卵巢功能[2，3]等作用。但儿童血清AMH参考范围的缺乏，阻碍了其在儿科的广泛临床应用，而且不同种族人群，AMH水平存在一定差异[4]，因此，迫切需要建立适用于我国儿童的参考区间。本文拟采用横断面研究，建立湖北地区0-12岁儿童AMH参考区间，旨在为血清AMH在儿科领域广泛应用提供参考标准。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2018-03-2021-01在武汉儿童医院体检和门诊的健康儿童，依据CLSI C28-A3指南，所有被招募的儿童均接受标准的身体和医学检查。纳入标准：0-12岁，身体健康，男女不限，血常规、肝、肾功能正常，血糖正常。排除标准：患有特纳氏综合症，可疑的性发育异常，多囊卵巢综合症，卵巢早衰，单侧或双侧隐睾，内分泌疾病，遗传性代谢疾病，肝功能不全，肾脏功能不全，循环系统疾病，手术史，急性或慢性感染的患者，肥胖者[5]。共纳入男童645例，女童633例，依据Tanner分期和AMH分泌特点[6]，将男女童按年龄段分别分为五组， 1天-364天组、365天-1岁11个月组、2-4岁组、5-8岁组、9-12岁组。本研究经本院伦理委员会审核同意。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理: 根据CLSI C56-A文件中的建议[7]，建立儿童血清学AMH参考区间。用不含抗凝剂的干燥真空管采集研究对象静脉血1.5ml，静置30min后，以3 500rpm离心15min分离血清。如果存在溶血，黄疸或血脂异常，则剔除样品。将合格的血清样品存储于-80℃下。

1.2.2 血清AMH的检测: 依据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的标准操作程序进行，采用美国贝克曼Access 2型全自动免疫分析仪和配套的试剂、标准品和质控品，检测血清AMH水平。

1.2.3 离群值的处理: 按照CLSI C28-A3文件要求，采用Dixon法(即D/R比值)判断离群值(D值为某数据与邻近数据的差值，R值为数据全距)。D/R≥1/3的数据判为离群值，舍去；D/R<1/3者保留。

1.2.5 不同年龄段AMH百分位数: 采用LMS法构建不同年龄段AMH百分位数，包括P2.5、P5、P10、P25、P50、P75、P90、P95、P97.5共9个百分位点。LMS法是用中位数曲线(M)、变异系数曲线(S)和不对称曲线(L)全面描述研究AMH水平在各个年龄段的分布。采用LMS法拟合百分位数曲线时，需选择适宜的Box-cox转换值(L)、中位数(M)及变异系数(S)的自由度值及其他相关参数。

1.2.6 参考区间的验证: 按照CLSI C28-A3文件的要求，随机选取1天-364天、365天-1岁11个月、2-4岁、5-8岁、9-12岁年龄段健康女孩各20例，及选取1天-364天、365天-1岁11个月、2-4岁、5-8岁、9-12岁年龄段健康男孩各20例，采用相同的仪器及试剂进行血清AMH检测，验证检测结果是否在所建立的参考区间内。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各年龄组男女童血清AMH参考区间

因不同年龄段男童和女童血清 AMH 水平的频数均呈非正态分布，采用双侧限值(P2.5，P97.5)，即95%的置信区间建立湖北地区健康男孩和女孩AMH的参考区间(见表1)，健康男童出生时，血清AMH水平较高，出生后略有增加，从2岁起持续下降至12岁。健康女童出生时，血清AMH浓度较低，出生后逐渐增加，在9岁时达到峰值，然后逐渐降低至12岁。

表1 各年龄段男、女童血清 AMH 参考区间(ng/ml)

2.2 各年龄组男女童血清AMH百分位数值

采用LMS法计算男童和女童不同年龄段血清AMH第2.5、5、10、25、50、75、90、95、97.5 百分位数见表2和表3。

表2 各年龄段男童血清 AMH百分位数值(ng/ml)

表3 各年龄段女童血清 AMH百分位数值(ng/ml)

2.3 参考区间验证

在随机选择的1天-364天、365天-1岁11个月、2-4岁、5-8岁、9-12岁各年龄段健康女童和男童中，女童每组各有19、20、20、19、19例受检者血清AMH水平在所建的参考区间内，男童每组各有20、19、19、19、20例受检者血清AMH水平在所建的参考区间内，符合实验室质量管理要求。

3 讨 论

儿童性发育相关疾病，种类繁多，病因复杂，实验室评估指标少，导致诊断困难。AMH参与下丘脑-垂体-性腺轴调控的儿童性发育过程，并在男胎缪勒管退化及性腺发育过程中起关键作用[8]，AMH水平的异常变化可提示儿童性发育相关疾病的发生，作为儿科评估卵巢与睾丸发育及病理状况的生物标志物[9]，AMH将在儿科内分泌疾病诊治及疗效评估中具有广泛的应用前景。本研究发现，健康男童出生时，血清AMH水平较高，出生后略有增加，从2岁起持续下降至12岁，女童AMH分泌水平与男童显著不同，女童出生时，血清AMH浓度较低，从出生开始持续增加，至9岁时达到峰值，从9岁到12岁，AMH的水平下降，提示健康儿童血清AMH水平在性腺发育不同时期有不同的表达，与Jopling等[10]报道结论一致。

全自动化学发光平台为临床开展AMH检测提供技术支持。本研究采用全自动Access AMH系统检测AMH，批内CV为1.58-2.60%，批间CV为2.07-3.27%。而Aksglaede[11]采用Gen Ⅱ ELISA方法报告的男性AMH的参考区间，批内CV为6-8%，批间CV为10-12%，本研究所采用的全自动化学发光法检测的批内和批间CV明显低于Gen Ⅱ ELISA方法。随着检测技术的发展，血清AMH水平的测定方法不断改进，过去运用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测技术，存在AMH检测结果不稳定，重复性差，速度慢等问题[12]。全自动化学发光Access AMH检测系统，具有灵敏度高、特异性强、重复好，速度快等优势，将逐步取代ELISA方法，因此采用全自动化学发光法建立的血清AMH参考区间更具有应用前景[13]。

AMH的深入研究及儿科广泛临床应用依赖于AMH参考区间的建立。本研究建立的湖北地区0-12岁男童和女童AMH参考区间，比Yates等报道[6]的英国男童和女童的AMH参考范围略高，进步一步证实不同种族人群，AMH水平存在一定差异[4]，Yates等报道[6]的儿童参考区间，每个亚组人数约为40例左右，其例数未达到美国临床和实验室标准化协会CLSI C28-A3 文件的要求，该文件指出，使用非参数统计方法计算临床检验项目参考区间时，亚组例数不少于120例，此参考范围是否可靠有待进一步验证。近年来，西方国家、北京协和医院及湖北省人民医院均建立了19-50岁成年女性AMH参考区间[14，15]，并已在卵巢早衰、多囊卵巢综合征、卵巢颗粒细胞瘤、辅助生殖等领域有着广泛的应用[16]。我国儿童AMH参考范围的建立，有利于在儿科领域的广泛应用。

综上所述，本研究采用横断面研究，运用Beckman Access2全自动化学发光免疫分析法，建立了湖北地区儿童0-12岁AMH参考区间，为AMH深入研究提供理论基础，也为AMH在儿科领域广泛应用提供参考。

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