基于网络药理学的水蛭-蜈蚣药对治疗糖尿病性勃起功能障碍的作用机制研究

王旭昀 胡志伟 蒋子康 胡金涛

1.首都医科大学附属北京中医医院男科，北京 100010；2.辽宁省大连市中医医院康复科，辽宁大连 116013；3.厦门大学医学院中医系，福建厦门 361102；4.北京中医药大学东直门医院儿科，北京 100070

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指因多种原因造成的阴茎海绵体血液充盈不足，不能完成性交，是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见的并发症之一，发病率较高[1]。男性DM 患者发生ED 的病因复杂，包括血管、平滑肌及神经功能受损等。中医学则认为血瘀是糖尿病性勃起功能障碍（diabetic erectile dysfunction，DED）的重要病因病机之一，在临床上采用活血法治疗该病获得了一定的临床效果[2]。水蛭-蜈蚣药对是治疗DED 的主要活血药物组合，效果确切，然其作用机制并不明确[3]。因此，本研究拟通过网络药理学的方法对水蛭-蜈蚣药对治疗DED 的靶标进行筛选，以期揭示活血法治疗DED 的机制。

1 资料与方法

1.1 水蛭-蜈蚣药对有效成分与潜在靶点筛选

通过中国知网查阅2017 年1 月1 日至2020 年2 月10 日的相关文献[4-22]获得水蛭-蜈蚣药对的成分，查询并阅览PubChem 数据库得到这些成分的分子结构式，输进Swiss Target Prediction 数据库得到成分所对应的靶点，过滤无效成分及靶点。

1.2 水蛭-蜈蚣药对药物-成分-靶点网络构建

使用UIbot Creator 软件对成分重新编码后，汇总2 种药物的成分与靶点，构建药物-成分-靶点网络，使用Cytoscape 3.8 软件绘图并分析，可得各个要素的degree 值。

1.3 DM-ED 靶点的收集及药物-疾病共同靶点的筛选

以“erectile dysfunction”“diaBetes”为关键词，录入Genecards、OMIM、DrugBank 等数据库网站查询靶点，获取与DM-ED 相关靶点后去重，使用Python 3.7 的Matplotlib-venn 库绘制维恩图，并获得该药对与DMED的交集靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

将水蛭-蜈蚣药对、ED 的相同靶点使用STRING数据库的应用程序接口构建上述交集靶点的网络（置信度＞0.4），使用Cytoscape 3.8 软件分析并绘图，依据度中心度（degree centrality，DC）、中介中心度（betweeness centrality，BC）、接近中心度（closeness centrality，CC）及邻里连通性（neighborhood connectivity，NC）四值大于等于中位数，进一步筛选核心靶点。

1.5 获得核心成分并构建、绘制核心成分-核心靶点网络

核心靶点所对应的成分即为核心成分，使用UIbot Creator 查出核心成分，构建核心成分-核心靶点网络并使用Cytoscape 3.8 软件进行绘图分析。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

Metascape 数据平台对核心靶点进行分析，如GO富集分析可获得水蛭-蜈蚣药对治疗DED 潜在的分子功能、细胞组分、生物学过程的GO 条目；KEGG 富集分析可获得水蛭-蜈蚣药对治疗DED 最有可能调控的信号转导通路。

2 结果

2.1 水蛭-蜈蚣药对的有效成分与潜在靶点筛选

根据设定的条件筛选出2 味药物有效成分47 个、靶点534 个。每味中药的成分数量如下：水蛭15 个、蜈蚣39 个、共有成分7 个。将degree 值＞30 作为筛选标准，水蛭-蜈蚣药对主要有效成分见表1。以拼音首字母为编码标准，水蛭成分编号为SZ1～SZ15，蜈蚣成分编号为WG1～WG39，共有成分编号为GY1～GY7。

表1 水蛭-蜈蚣药对主要有效成分基本信息

2.2 水蛭-蜈蚣药对的药物-成分-靶点网络构建

用Cytoscape 3.8 绘制水蛭-蜈蚣药对“药物-成分-靶点”网络，网络包含584 个节点、1552 条边（图1）。

图1 水蛭-蜈蚣药对成分靶点-网络

2.3 DM-ED 靶点的收集及药物-疾病共同靶点的筛选

在DrugBank 数据库获得ED 靶点650 个和DM靶点650 个，在OMIM 数据库获得ED 靶点109 个和DM 靶点123 个，去重后获得ED 靶点743 个和DM 靶点736 个。水蛭-蜈蚣药对与ED 和DM 的相交靶点为32 个。绘制维恩图见图2。

图2 水蛭-蜈蚣药对与糖尿病、勃起功能障碍靶点

2.4 PPI 网络构建

绘制PPI 网络如图3 所示，以DC≥3、BC≥0.039、CC≥0.4、NC≥4.5 为条件，筛选得出水蛭-蜈蚣药对与ED 和DM 的3 个核心靶点。

图3 水蛭-蜈蚣药对与糖尿病、勃起功能障碍核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络

2.5 “核心成分-核心靶点”网络构建

“核心成分-核心靶点”网络如图4 所示，网络分析可见表2。

表2 药物活性成分-核心靶点网络分析（degree 值>2）

图4 核心成分-核心靶点网络

2.6 GO 与KEGG 富集分析

通过GO 富集分析共获得18 个GO 条目，其中有生物学过程14 个，包括细胞内雌激素受体、细胞内类固醇激素受体、类固醇激素介导等；分子功能4 个，包括核受体活性、转录因子活性、直接的配体调节序列特异性DNA 结合等；未获得细胞组分相关条目。KEGG 分析结果获得仅1 条通路，即癌症通路。

3 讨论

《本草纲目》认为水蛭能够破血逐瘀、通经，为破血逐瘀之猛剂[23]。现代药理学认为水蛭能阻止凝血酶对纤维蛋白原的作用，阻碍血液凝固；蜈蚣具有走窜之性，尤善于化瘀通络，能够深入邪气结聚之处，使得瘀血去，新血生，现代药理研究表明蜈蚣具有扩张血管的作用。血瘀是导致DED 的主要病机，水蛭-蜈蚣二者合用共奏活血通络起痿之效，故可用来治疗DED[24-25]。在临床上二药配伍应用取得了一定的效果，然其作用机制并不明确，限制了其进一步的开发应用，探讨其临床作用机制已成为目前临床的热点之一。

基于以上现状，本研究查阅相关文献共筛选出47 个水蛭-蜈蚣药对的主要有效成分，包括胆固醇、亚麻酸、菜油甾醇、亚油酸等。根据PPI 网络得到3 个核心靶点，主要包括AR（androgen receptor）、ESR1（Estrogen receptor alpha）、ESR2（Estrogen receptor beta），因此该药对可能作用于这3 个靶点恢复DED 患者的勃起功能，从而达到治疗DED 的目的。今后关于水蛭-蜈蚣药对治疗DED 的基础研究可围绕上述关键点开展，以进一步探讨其作用机制所在。这对临床改善DED 的治疗效果提供用药指导、开发治疗DED 的新型药物提供药理学基础具有一定的意义。