牡蛎胰岛素相关多肽3 克隆表达及纯化

杨丙晔 李 莹 陈仲巍

厦门医学院厦门市海洋药用天然产物资源重点实验室，福建厦门 361000

牡蛎属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎科，是一类非常重要的海洋经济物种，其蛋白含量丰富，肉质鲜美，是人们非常喜爱的海洋食物之一，素有“海中牛奶”的美称[1-2]。牡蛎地理分布广泛，沿海的国家、地区几乎都有牡蛎的分布，且生长迅速，产量高和经济效益好，是世界各国重要的海水养殖种类[3]。中国是世界第一海水养殖大国，牡蛎的养殖产量也位居世界首位[4]。到2007 年，牡蛎养殖产量达到海洋养殖总产量的1/3，是中国海水养殖产量最大的种类。但近几年牡蛎的养殖也出现了种质退化的问题[5]，其中主要的问题就是生长慢、成熟个体小型化、品质下降[6-7]，解决这一问题除了培育新品种，近年来有研究学者发现体外添加胰岛素样生长因子可以促进双壳类软件生物的生长[8]。

在哺乳动物中，胰岛素超家族在生长发育、代谢和寿命等方面具有重要的调节控制作用[9-11]。胰岛素超家族主要包括四类：胰岛素、胰岛素样生长因子（insulin growth factor，IGF）、松弛素和胰岛素相关多肽（insulin-related polypeptides，IRP）。胰岛素超家族相对比较保守，研究发现胰岛素超家族对生物体的多种生理过程都有重要调节作用[12]。IGF 主要在脊椎动物中起调节作用[13]，IRP 主要在无脊椎动物中被发现起作用。利用大肠埃希菌表达脊椎动物的IGF 已经有很多报道[14-15]，使用大肠埃希菌表达海洋无脊椎动物的胰岛素相关多肽还未见报道。本研究利用原核表达系统，表达纯化牡蛎IRP3 蛋白，为IRP3 蛋白的抗体制备和体外作为生长因子添加剂的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒提取试剂盒（Plasmid DNA extraction kit，DP1103）和DNA 胶回收试剂盒（DNA gel Extraction Kit，DP209）购自天根生化科技有限公司；T4 DNA 连接酶（T4 DNA Ligase，M0202L）和Taq DNA 聚合酶（Taq DNA Ploymerase，C11304-011）来自宝生物工程有限公司；ECL 显色试剂盒（Enhanced chemiluminescent detection reagent kit，SW2020）购自泰德生物科技有限公司；质粒pET30a 和菌株E.coli BL21 实验室保存。

1.2 IRP3 基因克隆构建和筛选

利用全基因合成技术合成IRP3 基因，并在IRP3基因两端加入限制性酶切位点Nde Ⅰ和Hind Ⅲ，利用双酶切和连接技术将IRP3 基因克隆构建到载体pET30a 中，然后转化Top10 感受态细胞，在含有卡那霉素（Kanarnycin，Kan）的LB 平板培养基上筛选长出的阳性菌落，分别利用双酶切和测序的方法确认构建载体的准确性，提取阳性质粒转化BL21（DE3）表达菌株。

1.3 IRP3 蛋白表达及鉴定

挑取BL21（DE3）阳性表达菌株单克隆，接种到4 ml的含有Kan LB 液体培养基中，37℃培养4 h，菌液OD600 达到0.8 时，向菌液中加入IPTG 使之终浓度为0.1 mmol/L，之后分别于15℃和37℃诱导表达培养。收集诱导后的培养液，12 000 r/min 离心5 min，去除上清液，加入PBS 液重悬菌液沉淀，最后加入上样缓冲液，于沸水浴中加热样品10 min，将样品12 000 r/min离心10 min，将上清液加入SDS-PAGE 凝胶中，电泳分离蛋白。分离好蛋白的凝胶考马斯亮蓝染色液染色，随后加入脱色液脱色直至凝胶没有蛋白的地方透明清晰。

1.4 IRP3 蛋白纯化

将所有菌液收集，加入含有20 mmol/L PBS（pH7.2），300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole（含1% Triton X-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/ml Leupeptin）裂解液，利用超声仪器（JY92-IdII，宁波新芝生物科技股份有限公司）进行超声破碎菌液，离心机离心收集上清液，利用Ni-IDA 亲和层析柱纯化表达的蛋白，利用SDS-PAGE 对纯化蛋白进行检测分析。用含有20 mmol/L PBS（pH7.2），300 mmol/L NaCl，8 mol/L Urea，20 mmol/L Imidazole 的缓冲液溶解包涵体，利用Ni-IDA亲和层析柱纯化包涵体裂解上清蛋白，利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测分析。

1.5 IRP3 蛋白的鉴定

利用SDS-PAGE 电泳和Western blot 技术，以BSA 作为对照，对纯化透析后的样品分别进行鉴定分析，SDS-PAGE 电泳后，一块胶用于考马斯亮蓝的染色，一块胶继续以恒电压100 V 转移60 min 进行转膜操作，将电泳凝胶中的蛋白转移到PVDF 膜上，然后经过膜封闭和6HIS 抗体的孵育结合，最后通过ECL 试剂盒显色，用仪器荧光观察拍照。

2 结果

2.1 IRP3 基因质粒克隆的检测结果

IRP3 基因序列长度为1818 bp，开放阅读框长度为483 bp，编码161 个氨基酸，NCBI 序列号为XM_011456859.3。琼脂糖凝胶电泳结果发现经过双酶切的样品泳道只有两个条带（图1），大小与pET-30a 和IRP3目的基因片段大小相符。显示pET-30a 和IRP3目的基因片段已成功进行了克隆构建。

图1 双酶切琼脂糖凝胶电泳

2.2 IRP3 蛋白诱导表达结果

SDS-PAGE 电泳结果发现诱导样品2 和3 都有目的蛋白表达，且表达量基本一致。但15℃过夜表达样品的蛋白条带更少，提示菌体内表达的杂蛋白相对较少（图2），15℃过夜培养表达更优。

图2 IRP3 蛋白的诱导表达

2.3 IRP3 蛋白的纯化

SDS-PAGE 电泳结果显示菌液普通裂解上清样品没有发现目的蛋白IRP3（图3）。包涵体溶解离心的上清及上清液纯化后的蛋白含有大量的目的蛋白IRP3，提示利用镍柱亲和层析的方法从包涵体裂解液中获得了较纯的IRP3 融合（图4）。

图3 上清纯化样品电泳

图4 包涵体纯化样品电泳分析

2.4 IRP3 纯化蛋白的鉴定分析

SDS-PAGE 电泳和Western blot 结果显示纯化的IRP3 蛋白样品条带单一且分子量与电泳指示一致（图5），说明纯化获得蛋白样品确实是IRP3 蛋白，与BSA 比较发现纯化的IRP3 蛋白样品纯度更高。

图5 IRP3 纯化样品的SDS-PAGE 和Western blot 分析

3 讨论

经过研究发现IRP 在贝类中也广泛存在，贝类中的第一个类胰岛素家族基因是在腹足纲的静水椎实螺（Lymnaea stagnalis）中发现的，并有7 个贝类IRP 基因被发现且在神经节中表达[16]。至今已在多种无脊椎动物中证实转录水平的调控与环境应激适应力有关[17]。目前普遍认为IRP 基因参与贝类的生长、发育和繁殖调控过程[18]。同时在长牡蛎中发现IRP 基因表达量增长期与长牡蛎的快速生长期和繁殖期时间是一致的[19-20]，这提示了IRP 基因可能对长牡蛎的生长和繁殖调控有重要作用[21]。

无脊椎动物中IRP 通过IRP 受体/胰岛素受体，激活MAPK 和PI3K/PKB 信号通路，调节生物的生长发育、新陈代谢、免疫和繁殖等各种生理过程。IRP 与胰岛素的结构有很大相似性，包括了信号肽，和A、B、C 三链。在蛋白表达修饰工程中，C 链会被剪切，这样由A 和B 链形成成熟结构，在生理过程调节中，一个存在于A 链内部的二硫键和A 链和B 链之间的二硫键起了至关重要的作用[22]，并且A 链和B 链内形成二硫键的半胱氨酸在生物进化过程中高度保守[23]。胰岛素相关多肽在无脊椎动物中广泛存在，其调控网络繁多且比较复杂，一般认为是由PI3K/PKB 通路和MAPK通路这两条信号通路组成，在这些通路组成上的各种因子会进行各种转录和翻译后修饰水平的调控[24-25]，由此调节无脊椎动物各种生长发育及新陈代谢生理过程[26]。本研究成功克隆获得含有IRP3-pET30a 质粒的BL21 表达菌株，从包涵体裂解上清液中获得了纯化的IRP3/HIS 融合蛋白，为IRP3 蛋白的抗体制备和作为体外生长因子添加剂的应用打下基础。