乳化剂对葡萄酒活性干酵母发酵性能的影响研究

张 衡，熊 涛，覃先武，卢 发，匡金宝，许引虎

（1.湖北省酵母功能重点实验室，湖北宜昌443003； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

酵母应用史和人类的发展史一样源远流长，在人类的社会生活中扮演着重要角色[1]。在酿酒行业，葡萄酒领域是规模化使用活性干酵母时间最早、范围最广、技术最成熟的行业,在20世纪60年代初,欧美各国的葡萄酒产区均已开始使用葡萄酒活性干酵母。我国从20世纪80年代末开始接触葡萄酒活性干酵母，在1997年，由位于中国湖北宜昌的中国食用酵母基地（现安琪酵母股份有限公司）推出了中国第一个本土葡萄酒活性干酵母1450，填补了中国本土葡萄酒活性干酵母的空白[2]。商业化活性干酵母具有方便储存、运输快捷、使用操作灵活等综合优点，在活性干酵母的生产过程中会对酵母细胞进行脱水干燥处理，最终制成的活性干酵母含水量在4.0%～8.0%之间[3]。在酵母生产的干燥脱水环节，会采用多种物理和生物工程技术，使酵母细胞失去所有的自由水和大部分的结合水，水分的缺失导致细胞膜水化层的丧失，为了避免葡萄酒酵母在干燥过程中的损伤，传统工艺会选择添加适量的乳化剂来保护酵母细胞，使活性干酵母产品达到相应的产品质量标准，满足食品发酵的技术需要[4]。2000—2010年中国葡萄酒产量保持了年均20%的复合增长率，在2010年突破了100万t[5]。工业生产中葡萄酒活性干酵母起酵速度过快，葡萄汁泡沫极其丰富，有很大的葡萄汁溢出风险。本试验探索酵母细胞在脱水干燥的后处理过程中乳化剂对葡萄酒活性干酵母在发酵过程中酵母细胞形态、活细胞数、葡萄酒的发酵周期、最终的发酵产品质量、起酵速度等方面的影响。目的是在不影响发酵周期和葡萄酒最终品质前提下降低葡萄酒活性干酵母在发酵过程中的起酵速度，以防止发酵过快的发生。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌种：酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)RV002，由安琪酵母股份有限公司生物技术研究院菌种库提供。

试剂：糖蜜、乳化剂、酵母抽取物、硫酸镁、硫酸锌等，均由安琪酵母股份有限公司生产技术中心提供。

仪器设备：BK1301生物显微镜，南京庚辰科学仪器有限公司；NRY-2110恒温摇床，上海南荣实验室设备有限公司；HDS-16-5卤素电子水分仪，上海方瑞仪器有限公司；C20-2小型自动发酵罐，德国贝朗公司；TDL-40B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；J26XP高速离心机，美国贝克曼公司；WBF-2G小型干燥床，重庆英造粒包衣技术格有限公司；E-50小型造粒机，重庆英造粒包衣技术格有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液培养

种子摇瓶培养：蔗糖100 g、酵母抽取物FM888 20 g、硫酸镁、磷酸二氢钾适量，定容至1 L，调节pH值，在180 r/min、30℃的摇床中培养24 h。

1.2.2 酵母的发酵

底物灭菌：将适量的MgSO4、ZnSO4、酵母抽取物定容至9 L，添加酸碱液调节pH值，121℃灭菌30 min。

接种：在无菌的条件下将1.2.1中的1 L种子摇瓶培养基接入发酵罐中。

发酵：用糖蜜作为碳源，硫酸铵作为氮源，磷酸二氢铵作为磷源进行发酵。pH值控制在3.3～6.8，转速在300～600 r/min，通风量控制在8～40 L/min，温度控制在29～36℃，等待酵母成熟后进行吹风，留酵母样进行下一步实验[6]。

1.2.3 酵母的干燥[7]

干燥工艺流程：酵母乳添加乳化剂/不添加乳化剂→过滤→造粒→干燥。

操作要点：

①酵母乳的过滤：乳化剂用80～90℃的热水配制,可按每100 L水里加12.5 kg配制，配好后保持65～70℃在压滤之前加入酵母乳中(加入的百分比为酵母乳折干后的百分比)，并保证混合均匀。

②板框压滤：板框压滤后的酵母块水分在65%以下。

③干燥：进入干燥床的空气湿度小于6 g/kg。进风温度控制在60℃，物料品温控制在52℃，干燥时间30 min。

1.2.4 干酵母指标检测

蛋白质、五氧化二磷、海藻糖、其他微量成分的检测参考安琪酵母股份有限公司Q/YB.J 06.101—2016《酵母生产过程分析方法》。

1.2.5 酒样常规理化指标测定

酒精、残糖、总酸、挥发酸的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析法》。

1.2.6 模拟葡萄汁配制

模拟葡萄汁配制，参考OIV国际技术标准进行配制，培养基由储液A、储液B、储液C三部分组成。

储液A：在375 mL蒸馏水中加入蔗糖240 g/L定容至500 mL。

储液B：在250 mL蒸馏水中加入6 g/L酒石酸、3 g/L苹果酸、0.5 g柠檬酸。

储液C：在250 mL蒸馏水中加入6 mg肌醇、0.2 g氯化钙、1.7 g YNB（参照表1），以及氮源（1 g/L DAP，1 g/L FM888）。

表1 YNB培养基 (μg/L)

将储液A、B、C混合后用4 mol/L氢氧化钾调节pH3.5。

1.2.7 活性干酵母发酵性能检测

采用250 mg/L的接种量，将称量好的活性干酵母提前放入10 mL的试管中，按照常规活化工艺规程，加入10倍酵母质量的38℃去离子水，使葡萄酒活性干酵母溶解完全[8]，将带有复水活化液的试管放入38℃的恒温水浴锅中活化20 min，再逐步加入少量的葡萄汁模拟汁，待酵母活化液的温度降至与葡萄模拟汁温差在10℃以内时，将酵母活化液接种到装有葡萄汁模拟汁的500 mL三角瓶中，每瓶装250 mL葡萄模拟汁，每个样品3个重复[9-10]。

1.2.8 发酵过程中细胞形态的观测

发酵过程中每24 h取1 mL发酵液用显微镜观察酵母的形态并拍照记录，观察发酵酵母细胞大小、细胞形状、出芽率、内含物、液泡等形态的改变[11]。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒活性干酵母理化指标的检测

从表2可知，不加乳化剂和加乳化剂的活性干酵母在蛋白质、五氧化二磷以及海藻糖方面差距在2%以内，无显著性差异。未加乳化剂的酵母细胞总数比加乳化剂的细胞总数多4%，差距不显著，在活细胞率方面，未加乳化剂的活性干酵母活细胞率比添加乳化剂的活细胞率少11%，有显著的差异。可见，乳化剂对葡萄酒活性干酵母的活细胞率是存在显著影响的。

表2 葡萄酒活性干酵母理化指标对比

2.2 酵母干燥过程中加乳化剂和不加乳化剂发酵动力的对比

从表3、表4和图1可知：

表3 发酵过程中失重情况

表4 运用minitab回归模型方差分析

图1 发酵每天失重差异性对比图

（1）起酵速度的影响：添加乳化剂的酵母第1天失重在6.24 g，未添加乳化剂的酵母第1天失重在1.88 g，未加乳化剂酵母起酵速度是添加乳化剂起酵速度的30%，P值＜0.0001，差异极显著，可见不添加乳化剂可以极显著降低葡萄酒酵母的起酵速度。

（2）发酵峰值的影响：第3天葡萄酒酵母发酵达到峰值，其中未加乳化剂的酵母发酵失重为12.6 g/L，添加乳化剂的酵母失重为11.4 g/L，未加入乳化剂的酵母峰值大于加乳化剂酵母的峰值10%，P值0.051，差异性不显著，可见未加乳化剂的葡萄酒酵母不会影响其在发酵过程中峰值的表现。

（3）对发酵时间的影响：添加乳化剂和未添加乳化剂的酵母均在7 d完成发酵（以每天失重小于1 g/L判断发酵结束），可见对酵母发酵周期无影响。

综上，不加乳化剂的活性干酵母的起酵速度会极其显著的变慢，但对发酵峰值影响不显著，对发酵周期没有影响。

2.3 发酵过程中酵母的细胞数

从表5可以看出，第1天未加乳化剂的酵母和加乳化剂的酵母的活细胞数相差14%，差异显著。但从第2天直至发酵结束，酵母的活细胞数趋于一致，经minitab计算P值为0.985，无显著的差异，且与发酵应用中验证一致。

表5 发酵过程中细胞数目的变化 (×107个/mL)

从显微镜中可以看出发酵第1天为酵母主要的出芽时间，随后酵母出芽较少甚至没有观察到，出芽率与酵母活细胞数的趋势一致，出芽率越高的细胞数越大，发酵第7天观察到酵母未加乳化剂和加入乳化剂的死亡率分别为14.73%、15.57%。在发酵过程中，酵母未加乳化剂和加入乳化剂的形态无明显的差异，酵母在发酵过程中出现几乎是圆形形状、大小不均一，最终细胞数目两者几乎一样。可见，酵母干燥过程中未添加乳化剂对酵母在发酵过程中的形态和最终活细胞数目无显著影响。

2.4 发酵完成后模拟葡萄酒的常规理化检测

从表6可知，通过葡萄模拟汁的常规理化检测发现，两者的残糖均在5 g/L以下[12]，均能完成发酵，最终发酵的葡萄模拟汁酒精度、挥发酸、总酸、pH值均无显著差别。

表6 葡萄酒常规理化指标

未加乳化剂酵母发酵的模拟汁和加入乳化剂的酵母发酵模拟汁最终酒的理化指标无明显差异，感官小组的评定是两者的感官无明显差异，可见未加乳化剂的活性干酵母不会影响葡萄酒的品质。

3 结论

在本实验中未加乳化剂会降低葡萄酒活性干酵母活细胞数，但在发酵开始后的第2天直至发酵结束两者的活细胞数目趋于一致，活细胞数目无显著的差异。也不会影响葡萄酒酵母在发酵过程中形态、最终活细胞数目、葡萄酒的发酵周期、葡萄酒模拟汁理化指标，且通过感官小组的评定葡萄模拟汁的品质无明显差异。

未加乳化剂的活性干酵母起酵速度是添加乳化剂发酵速度的30%，不添加乳化剂的活性干酵母可以极显著降低葡萄酒酵母的起酵速度，这样可以降低葡萄酒生产过程中第1天的发酵速度，减少葡萄汁泡沫的生成从而降低葡萄汁溢出的风险。