胶体金免疫层析法检测隐球菌荚膜抗原的诊断价值及隐球菌病患者的临床特征分析*

张晓慧，陆燕飞，许雨乔，倪 芳，刘根焰，夏文颖

南京医科大学第一附属医院检验学部，江苏南京 210029

隐球菌病是由隐球菌引起的一种亚急性或慢性深部真菌病。隐球菌属中对人致病的主要是新生隐球菌和格特隐球菌。格特隐球菌感染好发于免疫功能正常的人群，且具有明显的地域性，如热带、亚热带地区，我国则以新生隐球菌感染为主[1]。新生隐球菌为条件致病菌，广泛存在于土壤、干鸽粪、灰尘、人体体表、口腔和肠道中，可经呼吸道侵入人体，随血流播散至脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和其他脏器[2]。

新生隐球菌菌体周围有一圈肥厚的荚膜，是其主要的致病物质。作为其特有的分泌物，隐球菌荚膜多糖抗原的检测可为隐球菌感染的诊断提供依据。胶体金免疫层析法(CrAg-LFA)是近年新兴的一种辅助诊断隐球菌病的检测方法，具有简单、快速、特异度高、灵敏度高等特点[3]。本研究应用CrAg-LFA检测隐球菌荚膜多糖抗原，探讨其在隐球菌病诊断中的应用价值，同时对隐球菌病患者的临床特征进行了分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2020年6月于南京医科大学第一附属医院行隐球菌荚膜抗原检测的住院患者1 623例作为研究对象，其中男968例，女655例,送检血清1 349例，脑脊液(CSF)226例，同时送检血清和CSF 48例。隐球菌病诊断标准参照《侵袭性真菌病定义共识的修订和更新(2019年欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组第三版指南更新)》[4]《隐球菌病处理临床实践指南(2010年美国感染病学会更新)》[5]和《肺隐球菌病诊治浙江省专家共识》[1]。确诊患者均有病原学证据，包括活组织病理检查、病灶穿刺标本涂片和培养、CSF墨汁染色、真菌培养及荚膜抗原阳性。结合患者临床表现及典型的影像学检查，血清CrAg-LFA检测阳性可临床诊断为肺隐球菌病，并可作为开始抗隐球菌治疗的依据。

1.2试剂与仪器 隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂盒(胶体金法)购自美国Immuno-Mycologics公司；BACTECTMFX400全自动血液培养仪(美国BD公司)；法国生物梅里埃公司VITEK2-COMPACT全自动微生物分析仪及其配套的YST鉴定卡。操作步骤严格按照说明书进行。

1.3方法

1.3.1资料收集 收集隐球菌病患者一般资料、临床表现、实验室检查指标，一般资料包括性别、年龄、吸烟史、动物接触史等；临床表现包括无症状、发热、咳嗽、胸闷/胸痛、头痛、恶心、呕吐等；实验室检查指标包括白细胞计数(WBC)、C反应蛋白(CRP)、IgE测定水平、(1,3)-β-D葡聚糖检测(G试验)、半乳甘露聚糖抗原检测(GM试验)以及墨汁染色、培养结果等。

1.3.2隐球菌荚膜抗原检测(胶体金法) 将1滴标本稀释液加入小试管内，再加入40 μL标本(血清或CSF)，将试纸条的白端没入到标本液中，10 min后读取结果。结果判读：仅出现1个对照条带表明检测结果为阴性，出现2个条带(检测条带和对照条带)表明检测结果为阳性，若对照条带未出现说明检测无效，需重新检测。

2 结 果

2.1CrAg-LFA对隐球菌病的检测结果 结果显示，CrAg-LFA检测总阳性数48例，其中39例最终诊断为隐球菌病(肺隐球菌病35例，隐球菌脑膜炎2例，隐球菌败血症1例，播散性隐球菌病1例)，剩余9例未行进一步确诊检查，均以“肺部感染”为出院诊断。在1 575例CrAg-LFA阴性患者中有7例确诊为隐球菌病(肺隐球菌病6例，髂骨隐球菌感染1例)，剩余1 568例均排除隐球菌感染。CrAg-LFA对隐球菌病诊断的灵敏度为84.8%(39/46)，特异度为99.4%(1 568/1 577)。其中，血清CrAg-LFA在肺隐球菌病诊断中的灵敏度为85.4%(35/41)，特异度为100.0%(1 356/1 356)，阳性预测值为100.0%(35/35)，阴性预测值为99.6%(1 356/1 362)，而CSF CrAg-LFA在隐球菌脑膜炎诊断中的灵敏度(2/2)和特异度(272/272)均为100.0%。见表1。

表1 CrAg-LFA对隐球菌病患者的检测结果

2.2隐球菌病患者临床特征分析

2.2.1一般资料 46例隐球菌病患者中65.2%(30/46)存在基础疾病，有27例肺隐球菌病患者有基础病史，按比例依次为高血压病(48.1%)、慢性肝病(29.6%)、糖尿病(25.9%)、自身免疫性疾病(14.8%)、恶性肿瘤(14.8%)。此外，有14例肺隐球菌病患者无基础疾病。41例肺隐球菌病患者中，33例患者通过经皮肺穿刺活检病理结果得以确诊，8例通过CrAg-LFA检测、典型影像学特征、临床表现及治疗效果等被临床诊断为肺隐球菌病。41例肺隐球菌病患者中，男24例，女17例，年龄18～80岁，平均(47.0±12.8)岁。其中有11例患者有吸烟史，2例有明确鸽子接触史。隐球菌脑膜炎患者共2例，男、女各1例，年龄分别为29岁和63岁，未有明显的动物接触史。另有播散性隐球菌病、隐球菌败血症、髂骨隐球菌感染各1例，年龄分别为49岁、30岁、47岁，既往均无吸烟史及动物接触史。

2.2.2临床表现及实验室检查 在41例肺隐球菌病患者中，有23例患者因出现症状而就诊，常见症状依次为咳嗽、胸闷/胸痛及发热。在18例无症状的患者中，有14例在体检时发现肺部病变，均以“肺部病灶性质待查”为初步诊断收治入院。78%的患者就诊时无明显异常的肺部体征，部分患者可出现干湿啰音、呼吸音减低等。2例隐球菌脑膜炎患者中，其中1例因“发热伴头痛”入院，体格检查巴宾斯基征呈阳性，CSF检查中WBC、葡萄糖及蛋白升高、氯化物降低。另1例因“狼疮性肾炎”在住院期间出现头痛症状，CSF检查中仅出现蛋白升高及氯化物降低，余正常。2例患者的CSF培养、墨汁染色及CrAg-LFA检测均为阳性。见表2。

表2 主要隐球菌病患者临床表现及实验室检查[n/n(%)]

除以上41例肺隐球病和2例隐球菌脑膜炎外，本研究另观察到3例隐球菌特殊感染患者。1例播散性隐球菌病患者仅有头痛症状，脑膜刺激征为阴性，CSF培养及墨汁染色均未见到隐球菌，但其血清和CSF CrAg-LFA检测呈阳性，且肺穿刺组织病理检查见到隐球菌；1例患者因隐球菌感染发生败血症，外周血、CSF及骨髓中均培养出新生隐球菌，且CSF墨汁染色及血清CrAg-LFA检测均为阳性；1例患者因“右下肢疼痛伴活动受限”入院，血清CrAg-LFA检测呈阴性，经外科手术后病理活检结果提示为隐球菌感染。

2.2.3治疗 46例隐球菌病患者中，43例接受了抗真菌治疗。肺隐球菌病患者中35例使用氟康唑，2例服用伏立康唑，病情均好转，出院后予以序贯治疗；余2例因病情危重采用了联合治疗(氟康唑+两性霉素B)，1例患者主动放弃治疗，另1例患者回当地医院治疗，后随访患者死亡。2例隐球菌脑膜炎患者中1例因强烈要求出院未用药，另1例采用了联合治疗(氟康唑+两性霉素B脂质体)，症状好转，出院后续用氟康唑。3例隐球菌特殊感染患者均采用联合治疗，播散性隐球菌病患者予以两性霉素B脂质体联合氟胞嘧啶治疗，出院后继续口服氟康唑，预后良好；隐球菌败血症患者经氟康唑联合两性霉素B脂质体治疗不久后死亡；髂骨隐球菌感染患者手术后予以两性霉素B脂质体联合伏立康唑治疗，病情好转。

3 讨 论

既往流行病学统计发现，新生隐球菌最常见的感染部位是中枢神经系统，但近年来肺隐球菌病的发病率呈逐年上升趋势[6]。肺隐球菌病成为继肺曲霉菌病之后最常见的肺部真菌病变，占20%左右。由于隐球菌病患者的临床表现及影像学检查无特异性，故实验室病原学检测和组织学检查尤为重要。目前临床开展的实验室检测方法主要有墨汁染色、真菌培养、荚膜抗原血清学检测，如胶乳凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。本研究中肺隐球菌病患者痰涂片及培养均未检出隐球菌，考虑可能是病灶多分布在外周，送检标本菌量少及标本采集时间错过最佳培养时间等原因。有研究将传统的镜检及培养法与抗原检测进行了比较，结果显示前者对隐球菌的检出率极低[7]。近年研究发现CrAg-LFA对隐球菌病检测的灵敏度和特异度均高于胶乳凝集试验和ELISA，其对实验室设备的要求不高，操作简便、快速，10 min即可出结果，逐渐应用于临床[8]。

本研究对1 623例行CrAg-LFA检测的住院患者进行统计，发现共有48例为阳性，其中39例完善检查后最终诊断为隐球菌病。本研究有7例血清CrAg-LFA检测出现假阴性(6例肺隐球菌病，1例髂骨隐球菌感染)，考虑原因有肺外隐球菌负荷量较低、隐球菌荚膜缺失或感染处于早期等[9-10]。此外，日本一项研究发现在免疫功能正常的肺隐球菌病患者中，血清CrAg-LFA检测的阳性率较低[11]，本研究中6例假阴性肺隐球菌病患者中有4例免疫功能正常。因此，对于免疫功能正常的肺隐球菌病患者需结合临床表现、影像学和病理学检查综合诊断，以防漏诊。

本研究发现CrAg-LFA检测CSF标本的灵敏度和特异度均为100.0%。1例播散性隐球菌病患者CSF培养及墨汁染色均未见到隐球菌，但CSF CrAg-LFA检测为阳性，给予抗真菌治疗后患者的病情有明显好转，考虑原因为CSF中隐球菌量较少，传统实验室检查方法无法检出。欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和世界卫生组织已推荐将CSF CrAg-LFA检测作为隐球菌脑膜炎的首选检查[12]，且其阳性结果作为隐球菌脑膜炎的确诊标准[4]。同时，有研究表明CrAg-LFA滴度的检测可用于评估预后以及监测疗效[7,13]。本研究中有1例隐球菌脑膜炎患者入院时CSF墨汁染色、培养及CrAg-LFA检测均阳性，进行抗真菌治疗后，随着临床症状好转，墨汁染色及培养菌量减少直至转阴，CrAg-LFA滴度持续下降，直至完全治愈转阴。

G试验和GM试验作为临床真菌感染的重要实验室检测指标，其诊断范围并不包括隐球菌感染。对于怀疑肺部真菌感染的患者，当出现G试验和GM试验均阴性时，应高度怀疑是否存在隐球菌的感染，但本研究中有1例患者出现G试验阳性，考虑可能是因隐球菌荚膜丢失导致细胞壁中少量(1,3)-β-D葡聚糖成分暴露。此外，本研究发现55.6%的肺隐球菌病患者出现了总IgE的升高，国外一项研究发现IgE除了在对抗寄生虫方面的经典作用外，还具有潜在的防御真菌的作用(如隐球菌)[14]。故IgE水平的升高可作为隐球菌病诊断的辅助检查。

隐球菌感染可出现在各年龄阶段，本研究中肺隐球菌病患者年龄主要集中在40～50岁，且男性较女性多见，提示中年男性是肺隐球菌病的高发人群。隐球菌病起病多隐匿，临床表现及体征均无特异性。2010年美国感染病学会更新的《隐球菌病处理临床实践指南》[5]中指出，隐球菌病的易感人群主要包括：人类免疫缺陷病毒感染者，器官移植患者，接受大剂量激素和/或免疫抑制剂治疗的患者，其他有基础疾病的患者。同时研究发现，对于免疫功能低下的患者，隐球菌更易播散至CSF、血液甚至骨髓中。

关于隐球菌病的治疗，《隐球菌感染诊治专家共识》[15]中指出肺隐球菌病的治疗目标是治愈感染，防止感染播散到中枢神经系统。对于免疫功能正常或症状较轻的肺隐球菌病患者可采用氟康唑，而免疫抑制伴弥散性感染或严重肺炎的患者治疗方案同隐球菌脑膜炎，即联合应用两性霉素B和氟康唑。本研究中35例肺隐球菌病患者使用氟康唑，另有6例隐球菌病患者接受了联合治疗。

综上所述，隐球菌病的发病率不断升高，免疫功能低下的患者易播散至血液或CSF，因此需要做到早诊断、早治疗。CrAg-LFA检测具有无创、准确率高、快速简便的特点，在隐球菌病的诊断中具有很高的临床应用价值。G试验、GM试验和IgE水平可辅助诊断隐球菌病。对于累及不同部位和不同免疫状态的隐球菌病患者，需严格按照指南用药。