应用酶联抗体检测系统性红斑狼疮患者血清抗体的有效性分析*

赖立川，吴荣才，蒙丹丽，王浜琴△

广西壮族自治区人民医院：1.检验科；2.风湿免疫科，广西南宁 530021

我国系统性红斑狼疮(SLE)发病率约为70/10万，20～40岁育龄期女性是其高发人群[1-4]。SLE的发病机制较为复杂，大量研究证实，SLE患者体内存在多种自身抗体，故自身抗体检测已逐渐成为诊断SLE及评估肾功能损害的参考项目之一[5-7]。其中抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗史密斯(Sm)抗体已被证实可用于SLE的诊断。而抗核小体抗体(AnuA)与核小体可形成免疫复合物，参与机体免疫炎性反应，同时，抗磷脂抗体可刺激机体免疫系统，但关于酶联抗体检测上述血清抗体对SLE疾病活动度的评估价值研究较少。基于此，本研究应用酶联抗体检测SLE多个血清抗体，并量化分析各抗体诊断SLE及评估疾病活动度的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2020年3月本院收治的88例SLE患者(SLE组)及88例体检健康者(对照组)为研究对象。根据系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)评分将SLE组分为轻度活动组(46例)、中度活动组(27例)、重度活动组(15例)，轻度活动为临床稳定，无明显内脏损害，SLEDAI评分<10分；中度活动为SLE明显累及重要脏器且需治疗，SLEDAI评分为10～14分；重度活动为SLE累及重要脏器，SLEDAI评分≥15分。SLE组男43例，女45例，平均年龄(43.66±12.15)岁，平均体质量指数(BMI)为(23.49±2.25)kg/m2；对照组男40例，女48例，平均年龄(45.09±11.86)岁，平均BMI为(23.61±2.14)kg/m2。两组间年龄、性别、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)SLE组均符合SLE诊断标准[8]，满足以下11项中4项或4项以上即可确诊，包括颊部红斑、盘状红斑、光过敏、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎、肾脏病变、神经病变、血液学疾病、免疫学异常、抗核抗体阳性；(2)对照组无自身免疫性疾病、血栓事件等。排除标准：(1)急慢性感染者；(2)处于妊娠期、产褥期或哺乳期等特殊时期的女性；(3)合并类风湿关节炎或其他风湿性疾病者；(4)合并肝、肾等重要脏器器质性病变者；(5)伴有再生障碍性贫血、白血病或其他血液系统疾病者；(6)近14 d内服用过激素、免疫抑制剂等影响检测结果的药物；(7)合并严重听力障碍、失语或精神行为异常者。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法 两组研究对象入院后24 h内于清晨8:00空腹抽取静脉血5 mL，1 000×g离心20 min(离心半径10 cm)，分离取血清，置于-20 ℃低温保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、抗β2糖蛋白1(β2GP1)抗体、抗心磷脂抗体(ACA)，严格参照南京赛泓瑞生物科技有限公司提供的试剂盒说明书操作，具体过程如下。(1)准备工作：将所需试剂及标本均平衡放置在20～26 ℃室温下，充分混匀，以1∶40对辣根过氧化物酶(HRP)清洗浓缩液进行稀释，并设置复孔。(2)标本检测：将预先稀释的抗dsDNA抗体(1 mL)、AnuA(1 mL)、抗Sm抗体(1 mL)及抗磷脂抗体ELISA低值阳性对照、高值阳性对照、阴性对照及稀释后血清标本分别置入微孔板，室温条件下孵育30 min。弃去孔内液体，并于各孔内加入稀释后洗涤液(300 μL)，吸除液体。重复上述清洗步骤2次后，于各孔内均加入HRP IgG酶结合物(100 μL)，室温条件下孵育30 min，重复上述清洗步骤。各孔内均加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物液(100 μL)，室温条件下避光孵育30 min。最后各孔内均加入HRP终止液(100 μL)，终止反应后60 min内于450 nm处读取各孔吸光度值。

1.3观察指标 (1)比较两组血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(2)分析血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA对SLE的诊断效能。(3)比较SLE组不同疾病活动度患者血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(4)分析血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平与SLEDAI评分的相关性。(5)分析血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA评估SLE疾病活动度的效能。

2 结 果

2.1两组血清抗体水平比较 SLE组抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清抗体水平比较

2.2各血清抗体诊断SLE的效能 ROC曲线分析显示，抗Sm 抗体、IgG-β2GP1、AnuA、IgG-ACA、抗dsDNA 抗体、IgM-ACA、IgM-β2GP1诊断SLE 的曲线下面积(AUC)分别为0.839、0.837、0.831、0.811、0.809、0.761、0.741，特异度分别为87.50%、90.91%、90.91%、94.32%、90.91%、90.91%、93.18%。见图1。

注：A为AnuA、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体诊断SLE的ROC曲线；B为IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1诊断SLE的ROC曲线。

2.3SLE组不同疾病活动度患者血清抗体水平比较 抗dsDNA抗体、AnuA、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平比较，重度活动组高于中度、轻度活动组，中度活动组高于轻度活动组(P<0.05)；抗Sm抗体在不同疾病活动度患者间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 SLE组疾病不同活动度患者各血清抗体水平比较

2.4各血清抗体与SLEDAI评分的相关性 Pearson相关分析显示，抗dsDNA抗体(r=0.782)、AnuA(r=0.752)、IgG-β2GP1(r=0.913)、IgM-β2GP1(r=0.938)、IgG-ACA(r=0.940)、IgM-ACA(r=0.975)均与SLEDAI评分呈正相关(P<0.05)。

2.5各血清抗体评估SLE疾病活动度的效能 ROC曲线分析显示，抗dsDNA抗体评估轻、中度活动的AUC为0.780，重度活动的AUC为0.819；AnuA评估轻、中度活动的AUC为0.791，重度活动的AUC为0.801；IgG-β2GP1评估轻、中度活动的AUC为0.744，重度活动的AUC为0.792；IgM-β2GP1评估轻、中度活动的AUC为0.708，重度活动的AUC为0.750；IgG-ACA评估轻、中度活动的AUC为0.771，重度活动的AUC为0.792；IgM-ACA评估轻、中度活动的AUC为0.783，重度活动的AUC为0.815。见图2、3。

注：A为AnuA、抗dsDNA抗体评估轻、中度活动的ROC曲线； B为IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1评估轻、中度活动的ROC曲线。

注：A为AnuA、抗dsDNA抗体评估重度活动的ROC曲线； B为IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1评估重度活动的ROC曲线。

3 讨 论

SLE的发病机制迄今尚未完全阐明，研究显示，SLE的发病过程中往往伴有T细胞参与和B细胞活化，一定程度上会侵犯多个器官与组织，产生多种免疫复合物，引起机体免疫调节紊乱，导致局部或全身性损伤[9-10]。同时，SLE患者外周血凋亡淋巴细胞会过度释放自身抗原，产生一系列自身抗体[11-12]。因此，早期检测自身抗体水平对辅助诊治SLE具有积极作用。

抗Sm抗体是公认的SLE标记性抗体，在临床应用较为广泛。本研究经ROC曲线分析发现，抗Sm抗体诊断SLE的效能优于抗dsDNA抗体、AnuA及抗磷脂抗体，特异度可达87.50%，与张树君[13]研究结果一致。但SLE患者中抗Sm抗体阳性者仅约30%，故抗Sm抗体阴性时无法排除SLE诊断，且单纯检测抗Sm抗体具有一定局限性，灵敏度较低[14-15]。同时，本研究结果显示抗Sm抗体与SLE患者疾病活动度无关，与张宗玮等[16]研究结果不一致，可能与纳入患者数量及SLE病情有关，有待进一步研究。

抗dsDNA抗体是SLE的分类标准之一，2012年通过SLE国际临床协作组(SLICC)验证成为独立诊断SLE的血清免疫学指标，并作为监测疾病进展的重要指标[17]。AnuA是SLE诊断的标记性抗体，国内动物实验表明，核小体能刺激机体产生AnuA，并诱导抗dsDNA抗体与组蛋白抗体生成[18]。本研究结果显示，SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA水平升高，与王之青等[19]、邢红宇等[20]研究观点相似，分析机制在于，抗dsDNA抗体通过与肾小球系膜细胞结合，参与细胞核内成分反应，诱导细胞凋亡，损伤肾脏，诱发狼疮性肾炎，同时SLE患者机体免疫系统异常，导致核小体在体内异常堆积，继而刺激机体产生AnuA，从而引起肾组织损伤。进一步经Pearson相关性分析可知，抗dsDNA抗体、AnuA均与SLEDAI评分呈正相关，结合孙佳莹等[21]、麻贞贞等[22]研究推测机制在于，细胞死亡过程中会促使碎片结构释放，产生免疫逃逸，而抗原可刺激自身免疫淋巴细胞、浆细胞的分化，诱导自身抗体产生并形成免疫复合物，随血液循环在肾小球基底膜及系膜区大量沉积，进而刺激补体系统释放大量相关细胞因子，过度消耗补体，从而增加急性肾功能衰竭的发生风险，加重病情。因此，早期明确SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA水平，可为临床制订个性化诊疗方案、控制疾病活动度提供有效辅助手段。最后，本研究经ROC曲线还发现，抗dsDNA抗体、AnuA诊断SLE的特异度均为90.91%，与李和军等[23]采用免疫印迹法检测的研究结果具有一致性，有力佐证了ELISA应用于抗dsDNA抗体、AnuA检测与免疫印迹法具有相似的特异度，但ELISA更加简便，易于批量操作，获取客观结果。

另外，由于抗磷脂抗体临床表现缺乏特异性，故诊断依赖于ACA、抗β2GP1抗体等实验室检测。根据2006年抗磷脂综合征(APS)悉尼国际分类标准，IgG、IgM亚型的ACA、抗β2GP1抗体均为APS的诊断标志物[24]。本研究通过对比研究可知，与体检健康者比较，SLE患者IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平更高，这可能是由于SLE患者存在广泛血管病变，血管壁损伤会刺激凝血系统，增强纤溶酶原激活抑制物活性，改变血栓调节蛋白活性，抑制蛋白C活化，引发获得性抗活化蛋白C现象[25-26]。同时，本研究结果还表明，随着SLE疾病活动度加重，血清IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平出现升高趋势，这与廖永强等[27]观点相似，可能归因于SLE患者体内存在较强的补体活化，补体C3、C4水平显著降低，从而参与炎性反应，上调体内多种炎症因子表达，引发内皮损伤，加重凝血-纤溶系统紊乱，引起继发性APS，表现为反复形成动静脉血栓、红细胞功能异常等，加重组织与器官损伤[28]。进一步经ROC曲线分析可知，ACA、抗β2GP1抗体对SLE疾病活动度具有较高的评估价值。说明早期采用酶联抗体检测抗磷脂抗体水平，对评估SLE疾病活动度、预防脏器损伤具有指导意义。但其是否能作为反映SLE患者疾病严重程度及预后的生物标志物，今后仍需进行大样本量、多中心的研究。

综上所述，SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体及抗磷脂抗体水平明显升高，且抗dsDNA抗体、AnuA及抗磷脂抗体水平与SLEDAI评分呈正相关，早期采用酶联抗体检测上述自身抗体水平，对SLE的诊断、疾病活动度评估具有重要意义。