miR-663调控MMP11对妊娠滋养层细胞侵袭和迁移的影响

段昆茂，王世芳△，陈周红

1.重庆医科大学附属第一医院綦江医院产科，重庆 401420； 2.重庆医科大学附属第三医院妇产科,重庆 401120

子痫前期是妊娠期高血压疾病的一种特殊类型，一般表现为妊娠女性在妊娠20周以后出现水肿、蛋白尿、高血压，在分娩以后血压恢复正常[1]。目前尚不清楚子痫前期的具体发病机制和病因，已知滋养层细胞是胎盘的主要组成部分，在胎盘形成和胎儿正常发育过程中具有重要作用，滋养层细胞侵入子宫螺旋动脉受限和过浅均可能够诱导子痫前期的发生，改善滋养层细胞侵袭和迁移能力可能是抑制子痫前期的重要步骤[2]。微小RNA(miRNA)是一类没有编码蛋白质功能的RNA，可以通过与靶基因的3端非翻译区(3′UTR)结合影响蛋白翻译[3]。miRNA的功能很多，如调控细胞分化、凋亡、炎症、衰老、氧化损伤、增殖等，还与很多疾病的发生有关[4]。既往研究显示，子痫前期患者胎盘组织中miRNA表达异常，且影响滋养层细胞的功能[5]。miR-663是与肿瘤有关的调控因子，还与鼻息肉的产生、烫伤修复等过程密切相关[6-8]。研究显示，miR-663在子痫前期患者中高表达[9]。目前尚不清楚miR-663在妊娠滋养层细胞迁移和侵袭中的作用。前期的预实验发现，miR-663和基质金属蛋白酶11(MMP11)的3′UTR端有互补结合位点，MMP11是基质金属蛋白酶家族成员，在细胞运动、侵袭过程中发挥促进作用[10]。本研究通过探讨miR-663调控MMP11对妊娠滋养层细胞迁移和侵袭的影响及机制，以期为改善子痫前期的预后提供方向。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年7月至2020年7月重庆医科大学附属第一医院綦江医院收治的妊娠期子痫前期患者行剖宫产留取的胎盘组织19例，同时收集健康妊娠女性行剖宫产留取的胎盘组织19例(对照组织)。

1.2方法

1.2.1实验细胞与试剂 妊娠滋养层JEG-3细胞购自上海通派生物科技有限公司；DMEM培养液、CCK-8、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；miR-663 模拟物(mimics)和抑制剂(anti-miR-663)、模拟对照序列(miR-NC)及抑制剂对照序列(anti-miR-NC)由上海安必奇生物科技有限公司构建；MMP11过表达载体及其小干扰RNA(si-MMP11)、空载体(vector)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、MMP11野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告载体均由湖南丰晖生物科技有限公司构建；MMP11、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自上海齐一生物科技有限公司。

1.2.2miR-663和MMP11 mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR检测miR-663和MMP11 mRNA表达水平。采用Trizol试剂提取子痫前期患者胎盘组织和对照组织中的总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA水平和纯度。然后利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，行PCR反应。PCR反应参数为：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共40个循环。利用2-△△Ct法分析目的基因的表达变化，miR-663内参为U6，MMP11 mRNA内参为GAPDH。PCR引物为：U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′；miR-663上游引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，下游引物5′-TTTAGGCGGGGCG-3′；MMP11上游引物5′-TTCTACACCTTCCGCTACC-3′，下游引物5′-GGACTGGCTTCTCACCATCATAT-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.2.3细胞培养和分组 复苏JEG-3细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液置于CO2培养箱中培养。将2.5 mL对数期JEG-3细胞(5.0×104个/毫升)接种至6孔板中，用LipofectamineTM2000脂质体法，分别转染anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、anti-miR-663(anti-miR-663组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-663 mimics(miR-663组)、Vector(Vector组)、MMP11过表达载体(MMP11组)，共转染anti-miR-663与si-NC(anti-miR-663+si-NC组)、anti-miR-663与si-MMP11(anti-miR-663+si-MMP11组)。同时设置对照组(Control组)：不进行任何转染操作，常规培养。转染6 h后，更换新鲜培养液。培养24 h后，采用qRT-PCR检测Control组、anti-miR-NC组和anti-miR-663组miR-663表达验证转染效果，具体方法同1.2.2；采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Control组、anti-miR-NC组、anti-miR-663组、miR-NC组和miR-663组细胞中MMP11蛋白表达水平，观察miR-663对细胞中MMP11蛋白表达水平的影响，同时检测Vector组、MMP11组、anti-miR-663+si-NC组、anti-miR-663+si-MMP11组MMP11蛋白表达验证转染效果。

1.2.4细胞增殖检测 采用CCK-8法检测Control组、anti-miR-NC组、anti-miR-663组、Vector组、MMP11组、anti-miR-663+si-NC组和anti-miR-663+si-MMP11组细胞增殖情况。将0.2 mL各组细胞(5.0×104个/毫升)接种到96孔板，培养24 h后，每孔加10 μL CCK-8。孵育3 h，在酶标仪上测定450 nm处吸光度(A)值。

1.2.5细胞迁移和侵袭检测 利用孔径为8 μm的Transwell小室测定Control组、anti-miR-NC组、anti-miR-663组、Vector组、MMP11组、anti-miR-663+si-NC组和anti-miR-663+si-MMP11组细胞迁移及侵袭情况。侵袭实验：预先在Transwell小室的上室添加人工基质胶，自然晾干。然后于上室加100 μL各组细胞悬液(5.0×104个/毫升)，下室中添加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液。在培养箱中孵育24 h，将Transwell小室取出，擦掉没有穿膜的细胞，放在4%多聚甲醛溶液中固定10 min，将小室取出，风干后进行苏木精染色。选择4个视野，计数细胞穿膜数量。迁移实验：除不铺基质胶外，步骤与侵袭实验相同。

1.2.6靶向关系预测及鉴定 采用生物信息学软件targetscan分析miR-663的靶基因。以荧光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系。将miR-663 mimics、miR-NC分别和WT、MUT荧光素酶报告载体共转染到JEG-3细胞，培养24 h后，用荧光素酶活性测定试剂盒分析细胞荧光素酶活性变化。

1.2.7MMP11蛋白表达水平检测 采用Western blot检测各组细胞中MMP11蛋白表达水平。将2.5 mL各组细胞(5.0×104个/毫升)接种至6孔板中，培养24 h后，弃培养液，用RIPA试剂提取细胞中总蛋白，用BCA法测定蛋白表达水平。用微量加样器取25 μg的蛋白样品分别加入SDS-PAGE凝胶样品孔内，接通电源。前30 min，以70 V的电压电泳，然后调整为100 V继续电泳约1.5 h，肉眼可见蓝色染料进入到底部边缘。取出凝胶，放在电转液内结合15 min。设置100 V的电压转膜1 h。电转结束后，将分离蛋白转移至硝酸纤维素膜，并浸泡在含有5%脱脂奶粉的平皿内，在室温孵育2 h。然后放在MMP11(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液中于4 ℃冰箱中孵育过夜，洗膜后，再放在二抗(1∶2 000)溶液中室温孵育2 h。滴加显影液避光显影，曝光拍照，分析条带灰度值。以MMP11与GAPDH灰度值的比值表示MMP11蛋白表达水平。

2 结 果

2.1子痫前期患者胎盘组织和对照组织中miR-663表达水平比较 与对照组织比较，子痫前期患者胎盘组织中miR-663表达水平升高(P<0.05)，miR-663在子痫前期患者胎盘组织中呈高表达，见图1。

注：与对照组织比较，*P<0.05。

2.2miR-663 inhibitor转染后妊娠滋养层细胞中miR-663表达水平比较 与Control、anti-miR-NC组比较，anti-miR-663组妊娠滋养层细胞中miR-663表达水平降低(P<0.05)，见表1。

表1 miR-663 inhibitor转染后妊娠滋养层细胞中miR-663表达水平比较

2.3下调miR-663对妊娠滋养层细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与Control、anti-miR-NC组比较，anti-miR-663组妊娠滋养层细胞增殖活性升高，迁移和侵袭数目增加(P<0.05)。下调miR-663能促进妊娠滋养层细胞增殖、迁移和侵袭。见表2。

表2 下调miR-663对妊娠滋养层细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.4miR-663与MMP11的关系 生物信息学软件显示miR-663和MMP11存在结合位点，见图2，提示miR-663和MMP11为靶向关系。与miR-NC组比较，miR-663 mimics和WT共转染后的妊娠滋养层细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，见表3。

图2 miR-663和MMP11结合位点

表3 miR-663 mimics和MUT、WT共转染后的妊娠滋养层细胞荧光素酶活性比较

2.5miR-663对MMP11表达的调控作用 与Control、anti-miR-NC组比较，anti-miR-663组妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达水平升高(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-663组妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达水平降低(P<0.05)，提示miR-663负调控MMP11表达。见图3、表4。

表4 miR-663 inhibitor转染后妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达水平比较

图3 miR-663 inhibitor转染后妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达情况

2.6子痫前期患者胎盘组织和对照组织中MMP11 mRNA表达水平比较 与对照组织比较，子痫前期患者胎盘组织MMP11 mRNA表达水平降低(P<0.05)，提示MMP11 mRNA在子痫前期患者中表达下调。见图4。

注：与对照组织比较，*P<0.05。

2.7抑制MMP11逆转下调miR-663对妊娠滋养层细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与Control、Vector组比较，MMP11组妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达水平升高，增殖活性升高，侵袭数目和迁移数目增加(P<0.05)。与anti-miR-663+si-NC组比较，anti-miR-663+si-MMP11组妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达水平降低，增殖活性降低，侵袭数目和迁移数目减少(P<0.05)。见图5、表5。

图5 Western blot检测妊娠滋养层细胞中MMP11蛋白表达

表5 各组妊娠滋养层细胞MMP11蛋白表达水平、增殖活性(A值)、侵袭数目、迁移数目比较

续表5 各组妊娠滋养层细胞MMP11蛋白表达水平、增殖活性(A值)、侵袭数目、迁移数目比较

3 讨 论

胚胎发育与功能性胎盘的形成有关，囊胚期的胚胎细胞分化形成内细胞团和滋养外胚层细胞，内细胞团分化形成胎儿，滋养外胚层细胞分化形成不同的滋养层细胞，滋养层细胞不断增殖分化，最终形成具有侵袭能力的多层绒毛外滋养层细胞，绒毛外滋养层细胞迁移、侵袭至子宫蜕膜，进入母体的螺旋动脉，维持子宫正常功能，为胚胎发育提供有利条件[11-12]。研究显示，滋养层细胞侵袭、迁移受限是子痫前期发生的关键原因[13]。

miRNA是一类长度在22 nt左右的非编码RNA分子，这类分子可在转录后调控其靶基因的表达[14]。miRNA在进化上极为保守，在不同组织和细胞中的表达丰度不同[15]。miRNA的异常表达常常与疾病有关，如miRNA在肿瘤中可发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，通过影响细胞的增殖、凋亡等发挥作用[16]。现阶段已经发现了数千个miRNA，影响人体内30%的基因表达，在生命进程中发挥十分重要的作用[17]。miRNA在子痫前期中可通过调控滋养层细胞的迁移和侵袭发挥作用[18]。既往研究表明，子痫前期患者胎盘组织中miR-663表达水平升高，提示miR-663可能参与子痫前期的发病过程[9]。本研究结果显示，miR-663在子痫前期患者中表达水平升高，并且下调miR-663可加快滋养层细胞的增殖，诱导细胞迁移和侵袭，miR-663可能具有加快子痫前期进展的作用。

miRNA的功能多样性与其调控机制有关，miRNA与靶基因的3′UTR端通过碱基互补结合，进而影响靶蛋白的表达，并且同一个miRNA可同时有多个靶基因，分别参与不同的生理、病理调控过程[19-20]。本研究发现，miR-663与MMP11的3′UTR端互补结合，并且miR-663靶向负调控MMP11表达。MMP11是基质金属蛋白酶家族成员，而基质金属蛋白酶家族是细胞外基质降解的关键蛋白酶[21-22]。细胞合成的基质降解酶能够为细胞的运动、迁移和侵袭提供条件[23]。本研究发现，子痫前期胎盘组织中MMP11表达水平降低，并且上调MMP11可增强滋养层细胞的侵袭、迁移和增殖能力，提示MMP11在子痫前期中可能发挥抑制作用。同时本研究还设置了逆转实验，证明抑制MMP11逆转了下调miR-663对滋养层细胞侵袭、迁移和增殖的促进作用，这进一步说明下调miR-663可使MMP11的表达下调，从而促进滋养层细胞的侵袭、迁移和增殖，miR-663在子痫前期中的作用机制可能与MMP11有关。

综上所述，miR-663可能具有促进子痫前期发展的作用，并且下调miR-663可靶向促进MMP11增强滋养层细胞的侵袭、迁移和增殖能力，目前尚不明确miR-663是否能通过其他途径影响滋养层细胞侵袭，这些内容会在以后的研究中进一步探讨。本研究为明确子痫前期的分子发生机制和靶向基因治疗子痫前期提供了思路。