南极海洋生物肠道微生物研究进展

朱国平,王 敏

1 上海海洋大学海洋科学学院,上海 201306 2 上海海洋大学极地研究中心,上海 201306 3 上海海洋大学 大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室极地海洋生态系统研究室,上海 201306 4 国家远洋渔业工程技术研究中心,上海 201306

海洋微生物在全球生物地球化学循环中起着关键作用[1]。然而,人们常常忽视了海洋生物对海洋微生物群落的贡献。与周围的水体相比,海洋生物代表着营养丰富且潜在的低氧环境,并为微生物定植提供了内外表面[2]。海洋生物提供的生态位多样性有助于维持海洋微生物多样性并为稀有微生物传播提供了途径[2]。肠道微生物可提供有关宿主生物的生态信息。已有研究表明,肠道微生物区系在宿主物种的免疫系统,代谢产物和健康中起着重要的作用[3],宿主可能会通过肠道微生物增强营养吸收和免疫功能[4]。针对海洋微生物的研究已成为近年来生物海洋学以及海洋生物学研究领域的热点,而开展海洋生物肠道微生物研究也成为全球微生物研究的新热点,尤其是该项研究为解决海洋生物摄食生态学研究提供了一条极具前景的研究途径。

远离人类社会的南极地区,终年气候严寒,冬季大多地区被冰雪覆盖。呈东向环极流动的南极绕极流(Antarctic Circumpolar Circulation, ACC)将南大洋及南极与外界系统隔离开来,从而形成了南极生态系统自身的特异性。极地环境经历了海冰覆盖、光照水平和白昼长度等极端的季节性变化[5],这导致原本栖息于南大洋的多数生物均逐渐灭绝,仅极少数生物能够适应这种极端环境并存留下来[6]。这些生物进化出了许多独特的特征,使它们能够在高纬度、持续低温的环境中生存并繁衍至今,这其中也包括栖息于此的微生物。尽管南大洋海洋生物的肠道微生物研究有着特殊的理论意义和重要的生态价值,但因南极的特殊地理位置以及恶劣的气候条件,南大洋海洋生物肠道微生物的研究仍较为有限,尤其是处于食物链中下端的鱼类和浮游生物,而国内更是鲜有关于南极海洋生物肠道微生物的报道。为此,本文以南大洋代表性海洋生物为目标,以南极海洋食物网中典型生物为主线,综述了南大洋海洋生物的胃肠道微生物研究概况,以期为深入开展极端环境下海洋生物肠道微生物适应性与功能机制研究提供基础信息和思路。

1 南极生物肠道微生物研究

基于高等生物的研究表明,肠道微生物相当于生物后天获得的“器官”,在宿主的营养代谢和免疫调节等方面均发挥着重要的作用[7]。尽管关于南极生物肠道微生物研究较为有限,但近些年来,南极生物的胃、肠道微生物的类型、适应机制等方面仍取得了一些进展[8- 9]。本文主要对南极具有代表性、位于南极食物网不同营养级的生物,如南极大磷虾(EuphausiaSuperba)、南极鱼类、企鹅及海豹等南极海洋生物的肠道微生物研究进行总结。

1.1 南极磷虾

磷虾属于甲壳类动物,目前共发现有8种磷虾类生活在南极海域,通常所称的南极磷虾一般指的是南极大磷虾(以下除特指外,均以磷虾简称)[10]。磷虾是南极海洋食物网中的关键物种。在南大洋,作为生物量极为丰富的初级消费者,磷虾将初级生产者与大多数营养级较高的捕食者,如鱼类、鸟类、海豹、鱿鱼和鲸鱼等联系起来,且在通过生物泵调节海洋碳储量过程中具有重要作用,一定程度上影响着地球生物化学循环,并在南极海洋生态系统中产生至关重要的影响[11- 13]。目前,针对磷虾的研究主要集中在分布、丰度以及开发利用磷虾油营养等方面[14- 15],少有研究涉及磷虾及其相关微生物之间共生关系的分子生物学和生物化学,许多与磷虾有关的微生物多样性与功能研究均处于探索阶段。

磷虾的体表和胃肠部存在着大量细菌的生长,是磷虾总消化过程的重要组成部分[16]。1990年,研究人员由南设得兰群岛将军湾捕获的磷虾胃中分离出一种菌株116,基于有限的形态学和生理学特征将其划分为少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonaspaucimobilis116,后来发现该菌株可以分泌一种具有独特性能的冷适应细胞外金属蛋白酶[17- 18]。Deener等[8]通过纯培养的方法测试了该菌株的形态学特征及生理生化特性,并利用高效液相色谱(HPLC)分析了DNA的碱基组成,发现该菌株与嗜冷杆菌属(Psychrobacter)的亲缘关系最为密切,且具有细胞严格需氧、强烈的氧化酶活性、嗜冷、嗜盐、革兰氏阴性非运动球杆菌、泛醌Q- 8等呼吸系统中主要酯醌等典型的嗜冷杆菌所具有的特性,从而将其命名为Psychrobacterproteolyticussp. 116。作为变形菌门(Proteobacteria)的重要微生物,嗜冷杆菌广泛存在于南大洋生态系统中,在南极海冰、冰藻类以及鸟类粪土中也发现了该菌种[19- 22]。嗜冷微生物分泌的酶在低温下具有高比活性,在一系列工业和产品中具有潜在的用途,如在食品加工中,作为清洗剂用于低温洗涤,用于高蛋白废物的降解以及分子生物学研究等。Psychrobacterproteolyticussp. 116的发现显示了南极微生物广阔的利用前景,但该研究未分析磷虾消化道微生物的系统发育、生物活性以及这些微生物对磷虾的影响。

有证据表明,磷虾消化道中的细菌可能参与宿主的消化过程,包括产生蛋白水解、脂质水解和几丁质水解酶等[17]。Cui等[23]针对2010年2月于斯科舍海捕获的磷虾消化道中获得了134种微生物分离物,去除重复的菌株后,选择75个代表性分离物进行测序并成功鉴定了包括42个真菌菌株,33个细菌菌株,其中8个菌株属于放线菌；进一步研究显示,真菌分离株属于子囊菌门(Ascomycota),包括五个属(青霉菌属Penicillium,枝孢属Cladosporium,曲霉属Aspergillus,篮状菌属Talaromyces和Meyerozyma),其中青霉菌属是主要的真菌群。细菌包括厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门,15株属于厚壁菌门,包括三个属(芽孢杆菌属Bacillus,葡萄球菌属Staphylococcus和动性球菌属Planococcus),芽孢杆菌属是所鉴定的主要细菌属。10株属于变形菌门包括γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和β-变形菌纲(Betaproteobacteria),两个属(嗜冷杆菌属和产碱杆菌属Advenella)。与磷虾相关的放线菌群落由放线菌门(Actinobacteria)链霉菌属(Streptomyces)的八个菌种组成,而链霉菌属则为唯一由磷虾体内分离的放线菌属。

在抗菌活性试验中,细菌和放线菌代谢产物显示出比真菌代谢产物更广泛和更强的抗菌活性,且抗菌活性集中于抑制水生致病细菌,尤其是创伤弧菌(Vibriovulnificus),其中嗜冷杆菌属和芽孢杆菌属细菌表现出最佳的抗菌活性[23]。致病细菌在南极地区也有广泛的宿主分布,通常会引起许多生物感染肠道疾病和伤口感染[20- 22],但磷虾似乎已形成一种免疫系统,以避免或抑制水生致病细菌和其它生物的入侵。例如,与非酶对照相比,磷虾酶对治疗静脉性腿部溃疡具有显著作用,且可以快速地促进伤口愈合[23]。在细胞毒性实验中,大多数真菌代谢物对肿瘤细胞系均表现出60%以上的抑制作用,这与阿霉素相当[23],该情况为开发海洋抗肿瘤药物提供了新思路；此外,该研究还分析了微生物的氟化钠(NaF)耐受性。虽然高浓度的氟化物对其它生物产生毒性效应,但它却是磷虾角质层形成的重要组成部分。研究表明,所有菌株均能在NaF条件下存活,大多数放线菌和一些真菌仍可产生细胞毒性产物[23],证明除了由宿主体内获得营养外,共生微生物还可利用其产生的细胞毒性和抗菌代谢产物保护宿主。

Clarke等[24]利用高通量测序比较了2016年1—2月采自凯尔盖朗群岛附近水域磷虾的蜕皮,胃,消化道和粪便相关的细菌群落与周围海水的细菌群落,发现两者之间存在着较大差异,磷虾胃和消化道中主要的菌群包括放线菌门,厚壁菌门,变形菌门和软壁菌门(Tenericutes)。尽管放线菌门占据极地深水中细菌群落的较大部分,但在南大洋任何水域中,其他三个门相对丰度均未达到1%；蜕皮中的磷虾个体细菌群落丰度与海水相似,而胃及肠道样本的多样性则低得多,该研究并未说明造成这种现象的原因[24]。

总的来讲,目前对磷虾肠道微生物的研究主要集中在夏季,采样地点也较为零散,但基本可以确定放线菌门、厚壁菌门和变形菌门在磷虾消化道中占据着主导地位[23-24]。但有关磷虾肠道微生物组成的影响因素研究仍较为有限。薛梅等[25]基于脂肪酸标记法发现,南极南乔治亚岛磷虾幼体冬季主要以浮游植物为食,而磷虾成体则多摄食桡足类等异养生物,幼体与成年个体肠道菌群是否因摄食而产生差异值得探究；且Zhu等[26]利用稳定同位素标记法研究南极秋至冬季磷虾营养的区域变化,发现南设得兰群岛附近的磷虾δ15N值明显高于布兰斯菲尔德海峡,认为进入冬季以后海冰逐渐推进到近海区域,海冰下的微生物可能成为磷虾的食物来源。由此,今后可以进一步探究栖息地环境改变造成的摄食变化是否会对磷虾的肠道菌群结构产生影响。

1.2 南极鱼类

生活分布于温度极低的南大洋鱼类超过300种,其中南极亚目鱼类占南大洋所有鱼类的46%[27- 28]。为了适应寒冷及高度氧化的环境,南极鱼类,尤其是鳄冰鱼科鱼类,获得了新型抗冻蛋白[29],而缺失了氧结合血红蛋白[30- 31]。鉴于南极鱼亚目的生态、形态及生理多样化,可以预见这些鱼类肠道微生物群落也进化到适应宿主的各种营养生活方式。由于鱼类肠道中缺乏厌氧菌(其在其它生物的肠道微生物群中占主导地位)[32],这也可能降低肠道微生物的多样性。南极鱼类因摄入富氧的海水,并支持依赖氧气进行呼吸的肠道寄生虫——蠕虫生存,致使其肠道基本上处于需氧状况[33]。目前,南极鱼亚目肠道微生物群落受到的关注相对较少。

涉及肠道菌群研究的南极鱼类主要包括多鳍南极鱼(Notothenianeglecta),革首南极鱼(N.coriiceps),短腹冰鱼(Chaenocephalusaceratus),伯氏肩孔南极鱼(Trematomusbernacchii),汉氏肩孔南极鱼(T.hansoni)和纽氏肩孔南极鱼(T.newnesi) 独角雪冰鱼(Chionodracohamatus),尖头裸龙鰧(Gymnodracoacuticeps),博氏南冰鰧(Pagotheniaborchgevinki),小鳞犬牙南极鱼(Dissostichuseleginoides),南极电灯鱼(Electronaantarctica),波氏原灯笼鱼(Protomyctophumbolini),梯氏原灯笼鱼(P.tenisoni),波氏裸灯鱼(Gymnoscopelusbolini),勃氏裸灯鱼(G.braueri)等(表1)。

表1 南极常见鱼类主要肠道菌群结构组成

针对以上研究的物种,采样地点,时间等均存在较大差异,故无法比较不同鱼种间的差异,且采样时间大多较短,因此建议进一步监测某一特定鱼类全年的肠道微生物组成变化。由上述几种鱼类肠道菌群研究中可以看出,研究手段的发展极大拓宽了人们对于南极生物的肠道微生物的认识。以伯氏肩孔南极鱼为例,采用纯培养的方式仅能分离出变形菌门的细菌,而采用16S rRNA基因Illumina MiSeq测序得到了放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、泉古菌门等更为丰富的菌群信息；摄食与栖息深度等生活习性不同的鱼类肠道菌群存在一定的差异。由此,未来可以更多地开展限制鱼类肠道细菌多样性特定因素的相关研究；此外,还应注意取样部位也会对结果产生一定的影响,如小鳞犬牙南极鱼中、后肠菌群就存在着较大的差异。

1.3 南极大型生物

1.3.1企鹅

众所周知,禽类肠道菌群主要通过将食物降解并转化为营养物质以便为宿主提供能量及通过分泌针对病原体的抗生素,从而维护宿主的健康,生长和繁殖[47- 49]。禽类肠道菌群的建立始于卵孵化阶段,直到成年阶段才趋于稳定[50]。企鹅主要以磷虾和南极鱼类为食,是南极海洋生态系统中最重要的消费者之一。企鹅沉积的粪便通过提供有机物质(例如,氮,有机碳和磷)使营养贫乏的南极土壤变得肥沃,这些富含营养的鸟粪土通常与多种细菌的繁殖有关,且与其它海鸟一样,企鹅种群也容易受到环境的影响[51]。对不同鸟类肠道菌群的分析,发现宿主的系统发育、摄食和栖息地均会影响肠道微生物的组成,而宿主的影响也较大[52]。Banks等[53]发现,阿德利企鹅(Pygoscelisadeliae)泄殖腔细菌群落存在种内变异,表明宿主系统发育的影响比地理位置影响更大,且细菌群落可以遗传至子代。

Dewar等[54]使用实时定量PCR与16S rRNA测序技术分析了南乔治亚岛伯德岛,克罗泽群岛和澳大利亚菲利普岛处于繁殖期的王企鹅(Aptenodytespatagonicus)、巴布亚企鹅(Pygoscelispapua)、麦克罗尼企鹅(Eudypteschrysolophus)和小蓝企鹅(Eudyptulaminor)等的粪便细菌群落,检测出13个门类微生物群,其中厚壁菌门,拟杆菌门(Bacteroidetes),变形菌门和梭杆菌门(Fusobacteria)为优势菌群,这与其它脊椎动物相似；但不同种的企鹅肠道菌群组成则存在着显著的种间差异,其致因值得进一步研究。此外,Dewar等[54]还检测出了已知病原体的存在,例如弯曲杆菌属(Campylobacter)和幽门螺杆菌属(Helicobacter)等。尽管这些菌种为人类和其它脊椎动物中已知的病原体,但对企鹅是否具有致病性需要进一步的研究。Yew等[55]研究了南奥克尼群岛阿德利企鹅和帽带企鹅(Pygoscelisantarctica)胃中的微生物,其结果进一步支持了Banks等[53]的发现,提出帽带企鹅个体间的菌群变异明显高于两个企鹅物种之间的变异,每个企鹅胃内均有其独特的菌群,并证实了摄食相关的细菌和海洋细菌存在于企鹅胃微生物群落中,这表明它们的摄食环境对体内微生物具有一定的影响。Yew等[56]比较两种企鹅的胃反刍物、泄殖腔内容物和新鲜沉积的鸟粪之间的细菌群落组成,发现新鲜沉积的企鹅鸟粪与胃反刍物,泄殖腔内容物菌群存在较大差异,认为企鹅中沉积鸟粪中的微生物无法广泛代表胃肠道微生物群。造成不同种企鹅胃肠道菌群的差异及环境对体内微生物影响的程度需要进一步扩大调查时间的跨度,如1年,以及进一步研究不同栖息地同种企鹅胃肠道菌群是否存在差异。

1.3.2海豹

哺乳动物出生时的肠道处于无菌状态,仅在发育过程中会定植不同的微生物[57]；随着哺乳动物的年龄增长,肠道微生物通过摄食,活动和环境变化变得丰富[58]。水下生活方式的限制使得海洋哺乳动物在其进化过程中经历了较大的生理和生态适应,而许多适应性进化延长了海豹水下觅食时间[59],这可能对肠道微生物群的组成有影响。南象海豹(Miroungaleonina)和豹海豹(Hydrurgaleptonyx)为肉食性动物,均栖息在南大洋及南极,南象海豹捕食鱼类,而豹海豹捕食部分海豹、磷虾、企鹅和鱼类等[60- 61]。Nelson等[62]收集了栖息于乔治王岛的南象海豹、南极半岛的豹海豹以及饲养在悉尼Taronga动物园的豹海豹粪便,利用标记PCR和基于16S rRNA基因测序的下一代测序技术对由粪便中提取的微生物DNA进行分析后发现,南象海豹和豹海豹的肠道微生物群中厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门和拟杆菌门为优势菌群；豹海豹肠道微生物中变形菌门丰度较高,特别是嗜冷杆菌属,这些细菌种类与磷虾,阿德利企鹅和巴布亚企鹅有关,它们是豹海豹的常见摄食对象,这表明微生物可以通过捕食者的摄食定植到宿主肠道中。Nelson等[62]还发现,肠道环境的理化特征会影响微生物的生存,南象海豹的肠道较长,其中可用氧气会因此稀释,故专性厌氧菌拟杆菌门丰度较高；相反地,γ-变形菌等兼性厌氧菌,在豹海豹的肠道中丰度更高。Kim等[63]利用16S扩增子测序研究了夏季乔治王岛摄食习惯相似的南象海豹(Miroungaleonina)和威德尔氏海豹(Leptonychotesweddelli)的粪便微生物群,发现两种海豹肠道菌群在门的水平上相对丰度无明显差异,但在科的水平上,海豹种类与性别之间的菌群丰度差异显著。两种海豹肠道微生物中厚壁菌门,拟杆菌门,梭杆菌门,变形菌门和软壁菌门为优势菌群[63],威德尔氏海豹肠道菌群的平均丰度高于南象海豹,两种海豹摄食略有差异,但均捕食鱼类和头足类；因此,作者推测宿主发育可能是影响肠道微生物组成的重要因素；爱德华氏菌属(Edwardsiella)只出现在雄性南象海豹肠道中,但由于样本量太少,无法揭示造成这种现象的原因。该研究预测了海豹肠道菌群的代谢潜力,发现与分类学组成结果不同,微生物功能群落组成和肠道代谢物谱在宿主物种或性别上无明显区别。上述研究均表明,厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门和拟杆菌门为海豹的优势菌群,但相对丰度会受到种类、性别的影响；目前对于海豹的研究较多集中在夏季,对于其它季节海豹肠道菌群的状况需进一步研究。

2 总结与展望

综合南极具有代表性生物肠道微生物研究可以发现,磷虾、鱼类、企鹅与海豹中普遍存在厚壁菌门和变形菌门。对同一科不同种生物的研究可以发现,虽然肠道微生物的优势菌群门类相似,但各种微生物的相对丰度存在较大差异,推测造成差异的原因与宿主发育状况,营养水平,性别等有关,但局限于样本数量,缺乏样本生理学数据,部分推测尚未得到证实,如裸灯鱼属鱼类营养级较电灯鱼属和原灯笼鱼属鱼类高是否会造成肠道菌群与其它两个属不同[38]；爱德华氏菌属仅在雄性南象海豹中检测到是否仅与性别有关[63]。此外,对南极海洋生物肠道微生物的研究大多集中在较短的时期(如夏季)内,尚未有针对某一生物全年的肠道微生物组成结构的调查；采样地点也较为有限,大多集中于某一海域范围内,缺少对磷虾等环南极分布生物的全面调查,这对于多数呈环南极分布的海洋生物(如磷虾,鱼类、企鹅、海豹及鲸鱼等)而言,尚无法阐释肠道菌落区域性与季节性差异的致因,这也限制了肠道微生物在生态学研究上的指示作用。

当前对南极的微生物研究大多集中在南极地区的土壤、海冰等区域，比如由南极土壤中发现的一种南极紫色小杆菌属非致病性细菌中分离出具有广泛抗肿瘤，抑菌和抗生素潜力的紫罗兰素。此前，此类紫罗兰素大多被发现存在于致病性细菌——紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)中，其药物潜力一直未得到开发，这一发现为紫罗兰素在制药的应用开辟了道路[64]。而虽然对于南极生物消化道内的微生物组成认识不断增加,但仍有一些问题值得进一步研究。例如,现有方法是否能使鱼类固有的微生物与鱼类周围环境或消化道内食物中可能存在的微生物有效区分开来？宏基因组学的发展,发现了大量过去无法得知的微生物种类,对了解微生物组成、进化和代谢具有重要意义[65]。未来研究较大的挑战之一便是要建立微生物组结构和功能与宿主的健康状况、年龄、遗传背景、地理位置以及其它个体差异的相关性,并揭示不同微生物在消化道菌群中的潜在作用,增进对南极生物应对气候变化以及宿主物种与肠道菌群之间相互作用和共同进化的理解。