指纹图谱技术在蛋白基食品品质鉴定中的应用

何晓峰，温小波，滕 博*

（汕头大学理学院，广东 汕头 515063）

前 言

随着生活水平的提升，人们对食品质量、食品安全的要求随之提高.蛋白质是人体必需的六大营养元素之一，从膳食中补充蛋白质是人体摄入蛋白质的主要来源[1].为确保蛋白基食品的安全和质量，我们需要建立完善的食品质量监管体系.目前已有相当多的食品质量分析和评价的方法，但是由于食品成分的复杂多变性，难以形成一个普遍有效的质量监控体系.指纹图谱技术则能够对食品组分进行全面分析[2]，可以特异性的表征食品内各营养成分的相互关系，在食品品质分析、掺假掺杂检测、产地鉴别等方面已得到广泛应用.

指纹图谱技术针对食品组分的多样性和复杂性特点，借助光谱、色谱等现代分析手段，获取能够体现食品共有特性的图谱[3-5].指纹图谱具有整体性、专属性、稳定性等特点，是一种有效的食品分析工具.蛋白质是蛋白基食品的主要营养成分，具有数量大、种类多、易变化的特点.蛋白质指纹图谱能很好地反映该蛋白基食品的特征，在蛋白基食品的生产质量管理、品质鉴定等方面有很大的应用价值[6].本文对近年来指纹图谱技术在蛋白基食品品质分析方面的应用进行了综述，以期为蛋白基食品质量管理体系的建立提供参考.

1 光谱法

光谱法是基于物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度的方法.由于其简便快速，灵敏度高的特性，在蛋白基食品分析方面应用广泛.常用的有傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、拉曼光谱、圆二色光谱、X射线衍射等，另外还有核磁共振波谱、质谱等方法.

1.1 傅里叶变换红外光谱法（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）

傅里叶变换红外光谱是在红外分光光度计的基础上发展起来的第三代红外光谱技术，是计算机技术与红外光谱技术相结合的应用，其将检测到的干涉信号，经过计算机的傅里叶变换，从而得到分辨率更高的图谱.在红外光的照射下，样品中的分子会吸收特定波长的电磁波，进而产生振动和转动跃迁，引起偶极矩发生不同的变化，通过检测这些变化，就能得到该样品的特征红外光谱.FTIR绝大多数有机物的基频吸收带一般都出现在中红外区（4 000～400 cm-1）[7]，这一区域又分为官能团区（3 700～1 700 cm-1）和指纹区（1 700～650 cm-1），官能团区峰少，比较固定，容易解析；指纹区峰复杂，变化大，可用于鉴定蛋白质的官能团以及蛋白质的分子结构研究.蛋白质在指纹区主要有3个特征带（酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带），分别是由C＝O的伸缩振动、N-H伸缩振动及弯曲振动、C-N伸缩振动产生的吸收带[8].Ashwini Kher等[9]人使用FTIR研究发现，不同喷雾干燥的乳蛋白浓缩粉的酰胺Ⅰ和Ⅱ带以及指纹区的红外光谱经过二阶导数和归一化处理去除物理性差异后，酰胺Ⅰ带的α-螺旋和β-折叠与酰胺Ⅱ带的峰形、谱带位移、吸收强度等变化显著，该指纹图谱可以很好地区分经过不同加工处理的乳蛋白粉.

FTIR图谱不仅可以研究蛋白质官能团的变化，经过去卷积、二阶导数、归一化、高斯拟合等处理之后，还可以得到其二级结构的变化信息.Manpreet等[10]将牛奶蛋白的红外光谱指纹图谱进行以上处理后，选取1 700～1 500 cm-1（酰胺Ⅰ带和Ⅱ带）区域进行高斯曲线拟合，发现不同处理的牛奶蛋白其酰胺Ⅰ带的α-螺旋（1 654～1 658 cm-1）、β-折叠（1 623～1 643 cm-1和 1 689～1 698 cm-1）、β-转角（1 666～1 687 cm-1）、无规则卷曲（1 646～1 650 cm-1）条带变化明显，根据高斯曲线积分面积还可以估算出各二级结构的含量百分比，这种指纹识别方法可以明显地识别出各种不同处理后的牛奶蛋白.目前F TIR大多采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR），该法操作简便，样品无需前处理，可以实现对样品的无损检测，已广泛应用于各种固体以及液体样品的分析.Aloglu等[11]利用ATR-FTIR结合模式识别方法，根据蛋白质红外光谱特征成功鉴定出牛明胶、猪明胶和鱼明胶，表明ATR-FTIR可用于鉴别动物明胶来源.

1.2 荧光光谱法（Fluorescent spectrometry，FS）

荧光是电子吸收光子能量后，产生振动跃迁，从激发态返回基态时，以辐射跃迁方式失去的能量.蛋白质发荧光的原因是其中含有芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）或者蛋白质活性中心含有金属原子等内源性荧光基团[12].荧光基团的种类、含量以及蛋白质的结构等都会对蛋白质的荧光强度、荧光波长、荧光寿命等性质产生影响，因此蛋白质荧光光谱具有一定的指纹性，可用于蛋白质含量测定、结构分析、相互作用分析、动力学分析等.例如Kokawa等[13]根据蛋白质受热结构会发生改变这一特性，建立了豆奶在不同温度加热下的荧光指纹图谱，结合偏最小二乘模型分析，成功预测了不同状态豆奶制品的加热温度，这对于豆奶的生产可以起到品质控制的作用.然而并不是所有的蛋白质都可以产生荧光，对于没有荧光特性的蛋白质，可以通过荧光染料、荧光探针、荧光标记蛋白质芯片等方法，将荧光物质与被检测蛋白质结合，使蛋白质荧光信号增强或减弱或猝灭，从而达到目标蛋白检测的目的.YuKi等[14]采用荧光标记结构肽制备的蛋白质芯片，建立了一种快速检测病人唾液中的蛋白质从而确定病人是否患有牙周病的方法.实验表明，通过检测标记肽的荧光强度变化得到的荧光指纹图谱，可以鉴定出健康者与患牙周病患者.

荧光光谱法中，根据检测目标的不同，又分为同步荧光光谱[15]、前表面荧光光谱[16]、三维荧光光谱等，其中三维荧光光谱以荧光强度、激发波长、发射波长作为维度，其立体图谱能够反映物质的荧光强度随着激发波长和发射波长而变化，所得的信息更为丰富，在构建指纹图谱方面具有广泛应用.牛乳中含有丰富的发色基团，具有不同的激发和发射波长，而且还有多种类型的蛋白质，可以结合不同的荧光染料；根据这两个特点，杜丽娟[17]采集了生鲜乳和掺入奶粉的还原乳的三维内源荧光光谱和二维外源荧光图谱，结合分类模型分析方法发现这两种图谱均可以用于判定还原乳的掺假程度，其准确率高达100%.

1.3 拉曼光谱法（Raman spectroscopy，RS）

入射光子和分子发生碰撞时，发生了能量转移，引起分子振动或转动，使入射光波长频率发生改变的非弹性散射称为拉曼散射，偏移的波数称为拉曼频移，其只与分子的振动和转动能级有关.拉曼光谱图与红外光谱图相似，是红外光谱的补充，它根据蛋白质分子的振动程度来构建蛋白质指纹图谱，目前是检测蛋白质二级结构、分子结构及构象的主流方法之一[18].与红外相比，它具有不受水分子干扰的优点，更适用于不同状态样品的检测.杨雪倩等[19]利用共聚焦拉曼光谱构建了不同霉变程度玉米的黄曲霉毒素（AFB1）和玉米赤酶烯酮（ZEN）的拉曼图谱，数据经过GaussLor拟合预处理，找到420～550 cm-1、790～980 cm-1和1 050～1 500 cm-1三个特征波段，归属为玉米毒素所在区域，以特征波长建立的BP神经网络模型可以更好地实现对AFB1和ZEN含量的预测，这为谷物品质的快速检测提供了参考.Yin等[20]对大豆球蛋白的二级结构进行拉曼光谱分析发现，大豆球蛋白的二级结构主要由21.50%的α-螺旋、41.62%的β-折叠、24.70%的β-转角和12.18%的无规则卷曲组成.

近年来，一些能提高拉曼光谱分辨率的衍生技术得到了飞速发展，例如紫外线共振拉曼光谱（UVRR）、深紫外线共振拉曼光谱（DUVRR）、表面增强拉曼光谱（SERS）、红外-拉曼光谱联用（IR-RS）等.其中SERS具有超高灵敏度特性，该技术能够极大限度地提供蛋白质样品固有的指纹信息.Tian等[21]通过分析溶菌酶和细胞色素c两种蛋白质主链的酰胺Ⅲ带的SERS信号，发现随着蛋白质浓度的增大，溶菌酶二级结构中的无规则卷曲会转变为α-螺旋和β-折叠；而细胞色素c的二级结构仍保持恒定的比例.以上研究表明我们可以通过拉曼光谱的方法建立蛋白质二级结构的指纹图谱，用以分析蛋白基食品在不同情况下的变化，从而进行品质控制.

1.4 圆二色光谱法（Circular dichroism spectroscopy，CD）

当光经过光学活性物质时，介质对左旋、右旋圆偏振光的吸收系数不同，二者的差值即为该物质的圆二色性.具有圆二色性的物质能够使平面偏振光偏转为椭圆偏振光，椭圆度与吸收系数差值成正比，圆二色光谱则是记录平面偏振光的波长与吸收系数差值的图谱.蛋白质是具有圆二色性的物质，其中的光学活性基团主要有肽键、芳香族氨基酸残基、二硫桥键，蛋白质光学活性不仅受基团影响，还受蛋白质折叠的影响[22]，因此可以得到具有特征性的圆二色光谱.蛋白质的圆二色光谱主要在较稀的溶液状态下测定，对于样品的纯度和制样要求较高，可以得到蛋白质的结构信息.李萌等[23]使用CD法得到羊乳和牛乳β-酪蛋白的圆二色图谱，分别在192 nm、185～200 nm、200 nm、206 nm的正峰出现α-螺旋、β-折叠、无规卷曲和β-转角的特征峰；分析结果表明，羊乳β-酪蛋白的无规卷曲含量比牛乳β-酪蛋白更高，分子结构趋向无序.Vanga等[24]采用CD法探究了脉冲超声加工对杏仁乳蛋白二级结构的影响，结果表明，随着超声时间延长，杏仁乳蛋白中的α-螺旋有向β-折叠转变的趋势.杨娇等[25]建立了两种不同干燥方式处理下的马铃薯蛋白质CD图谱，比较两者图谱发现，高压电场干燥（HVEF）会使蛋白质α-螺旋减少，其他二级结构增加，但总体变化比例相较于热风干燥对蛋白质二级结构造成的变化更小，这说明HVEF更适合对马铃薯进行加工.虽然圆二色光谱应用广泛，但也存在一些局限，例如样品中存在光吸收的杂质和缓冲液时会产生光散射现象，以及氙弧灯在200 nm以下波长区时发出的光源强度会突然下降，这些情况的出现对CD光谱的质量有较大的干扰，为了克服这些不足，逐渐发展起了一种利用同步加速器光束的辐射作为光源来采集样品CD信息的方法，这种方法称为同步辐射圆二色光谱（SRCD）[26].SRCD不仅可以研究蛋白质二级结构的细微变化，还可以监测蛋白质动态构象变化.Jochen等[27]使用SRCD研究了不同热处理下胶原纳米纤维的结构变化，随着加热温度的提高，原胶原纳米纤维的Ⅱ型聚脯氨酸（PP-Ⅱ）含量从60%～70%下降到30%～40%，并且胶原的三股螺旋结构进一步展开.这些研究证明了CD法是构建蛋白质指纹图谱的有利工具，在蛋白基食品品质控制方面具有重要作用.

1.5 核磁共振波谱法（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）

核磁共振波谱法是一种波谱技术，它的工作原理是添加一个入射频率与原子核自旋进动频率相同的射频场，原子核吸收射频场的能量，由低能态跃迁到高能态，从而产生核磁共振的现象.同一种原子核在不同的化学环境中具有不同的核磁共振频率，因此通过核磁共振，可以知道原子核的化学位移、共振信号强度等特征信息[28]，进而得到被分析物质的化学组成、基团结构，所以NMR是构建指纹图谱的强有力工具.近年来，核磁共振代谢指纹图谱在蛋白基食品鉴定的靶向和非靶向分析中得到广泛应用.Tenori等[29]人开发出了一种快速、可重复的牛奶核磁共振代谢组学指纹图谱分析方法，使用偏最小二乘模型（PLS-CA）对不同农场出产的牛奶进行1H-NMR图谱分析，发现不同农场的奶牛产出的牛奶其代谢物含量差异明显，从而明确区分有机奶和非有机奶，以及识别不同品牌的牛奶.Longobardi等[30]使用核磁共振氢谱分析了不同地理来源的扁豆的代谢物，认为代谢谱中的异亮氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、柠檬酸盐等信号区域是鉴别扁豆地理来源的重要依据.

信噪比是信号强度与噪声的比值，用于判断NMR图谱的质量.传统NMR图谱信噪比不高，在弱信号物质分析方面有很大缺陷，随着技术进步，已经发展出多种高分辨核磁共振波谱法，例如脉冲傅里叶变换NMR、低场核磁共振及成像技术（LF-NMR-MRI）、高分辨率魔角旋转核磁共振（HRMAS-NMR）、二维及多维核磁共振图谱等.Sujatha等[31]对来自韩国奶牛场的52份奶酪样品采用1H HRMAS-NMR分析，以找到奶酪样品的代谢物分布和浓度与感官评价的相关性.多元统计分析结果表明，根据感官评价分组的奶酪，不同组之间氨基酸和有机酸含量差异显著，是由不同加工过程中蛋白质水解和代谢造成，奶酪的1H HRMAS-NMR代谢指纹图谱与感官品质评价一致.

1.6 X射线衍射法（X-ray diffraction，XRD）

晶体中的原子排列具有周期性，当用X射线照射晶体时，由于X射线的波长与原子面间的距离相近，不同的原子会对X射线产生不同方向的散射，散射的X射线相互干涉，从而形成衍射图谱，这种方法称为X射线衍射法.XRD可以得到蛋白晶体的原子结构信息，是目前研究蛋白质三维结构最常用的方法之一，据统计，蛋白质结构数据库（PDB）储存的90%左右蛋白质结构数据都是由XRD法测得[32].不同蛋白质其空间结构不一样，具有特征性，因此XRD法非常适合用来构建蛋白质指纹图谱，能得到更全面的蛋白质信息.蛋白基食品大多为非结晶态，其中含有较多较杂且大分子量的蛋白质，较难得到纯的蛋白质晶体，但是利用XRD依然可以计算得到其结晶度、肽链距离、非结晶成分等信息.Chen等[33]通过XRD研究了不同高压对肌原纤维蛋白粉的加工作用，在2θ值为20°时，发现明显的非晶态结构峰，且随着压力的增加，达到15 000 psi时，肌原纤维结构完全被破坏，其非晶态结构峰值强度达到最低，表明加工后蛋白粉形成更多排列有序的晶体结构，但在压力达到20 000 psi时，过度加工会破坏这些晶体结构，使得非晶态结构峰值强度升高.Zhang等从小牛皮中提取胶原蛋白，经过超声处理后，使用XRD计算胶原蛋白分子链间的距离，根据布拉格方程：得到四种不同处理的胶原蛋白分子链间距离分别为1.197，1.190，1.187，1.180 nm；多肽链间的距离分别为0.285，0.281，0.287和0.292 nm.这些数据表明，超声波以及胶原蛋白浓度对胶原结构不会产生影响.Zhu等[34]对比了从鳐鱼和鲟鱼软骨提取的酸溶性胶原蛋白（ASC）和酶溶性胶原蛋白（PSC）的XRD图谱，ASC和PSC都显示含有两个衍射峰，第一个尖峰出现在5°～10°，代表胶原蛋白分子链间的距离；第二个宽峰出现在20°，为胶原内非晶态区域的弥散散射形成.结合CD和XRD的数据分析，表明这两种提取方法得到的胶原蛋白具有完整的三重螺旋结构.

XRD在蛋白质方面主要用于结构解析以及动态变化过程，目前发展出许多新型的X射线衍射技术，例如同步辐射X射线衍射、小角X射线衍射、广角X射线衍射、X射线自由电子激光衍射等，不仅能够更精确的表征蛋白质晶体，甚至有可能实现非晶体蛋白质的结构解析，因此，XRD是构建蛋白质指纹图谱的潜在有力方法.

1.7 质谱法（Mass spectrography，MS）

质谱的原理是物质分子在离子源的轰击下失去电子，并裂解为不同的阳离子，阳离子在电场和磁场双重作用下，按照质荷比（m/z）大小依次排列成谱.质谱法如今已成为蛋白质组学和代谢组学研究的重要手段之一[35]，可以精确测定蛋白质相对分子质量、元素组成、碳骨架及官能团结构信息，这些信息恰恰是蛋白质的“指纹”，因此也可以采用MS法构建蛋白质指纹图谱，用于食品的品质控制[36].质谱只能分析纯品物质，复杂以及大分子量的样品例如食品中的蛋白质则需要与高效液相色谱（HPLC）联用才能进行分析，这使得HPLC-MS联用成为蛋白质组学的主要方法.Gu等[37]通过超高效液相色谱-四极杆静电场轨道高分辨率质谱（UPLC-Q-Exactive-HRMS）分离大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的酶解多肽，再通过三重四极杆质谱（LC-QQQ-MS）进行多反应监测（MRM）分析，筛选出5种特异性肽生物标记物.最后以是否含有特异性肽GDPGPGGPQGEQGVVGPAGISGDK，对不同地区和不同批次的37个真实样品以及市售加工产品进行测试，检测出2个大西洋鲑鱼掺假样品.Ma等[38]也采用了同样的蛋白质组学方法鉴别食用燕窝及其掺假品.其筛选出的28个特异性肽标记物可用于区分燕窝与掺假品，这些特异性肽主要来源于酸性几丁质酶、赖氨酰氧化酶3、I型胶原α1链和α2链、溶菌酶、卵铁传递蛋白、卵清蛋白、ATP合成酶等.这为食品的掺假检测提供了有效、可靠的策略.此外，还有人通过LC-MS/MS来构建胶原蛋白肽质量指纹图谱，成功鉴定出11种鱼类[39].

质谱根据离子源的不同可以分为电喷雾离子化质谱（ESI-MS）、热喷雾离子化质谱（HEIMS）、二次离子质谱（SIMS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），再搭配不同的质量分析器（四极杆、飞行时间、离子阱），可以实现不同的检测需求.目前LC-MS和MS-MS串联使用的方法在蛋白质结构分析以及多肽氨基酸特异性序列分析中应用较多，这种方法更灵敏、分辨率更高、更精确，甚至仅用一段多肽就能鉴别蛋白质.这说明可以通过特征肽段来构建蛋白质指纹图谱[40]，用于食品蛋白质分析和鉴别.

2 色谱法

色谱法利用物质在流动相和固定相之间选择性分配的原理，在流动相的推动下，混合物中各组分以不同速度沿固定相移动，从而达到分离的目的.与光谱法相比，色谱法在分离和定量分析特定物质方面更有优势，在食品检测领域应用最为广泛.而蛋白质组学的兴起，推动了色谱与质谱联合应用技术的发展，使得高通量蛋白质检测得以实现，可以对各种基质中成千上万种蛋白质进行全面的定性和定量分析.目前已有许多学者将这种联合技术应用于蛋白质指纹图谱分析中，其中应用最多的是高效液相色谱-质谱联用，其次还有高效薄层色谱-质谱联用、高速逆流色谱-质谱联用、高效毛细管电泳等.

2.1 高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）

高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）具有的高压、高速、高效、高灵敏度以及适用性强等特点，使得高效液相色谱成为如今应用最广泛的分离检测技术.在食品蛋白质的分离分析方面，体积排阻色谱法（SEC）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）应用最多，已有一些学者将其用于食品蛋白质指纹图谱的构建，例如牛奶、水牛乳、蛤蟆油等.然而HPLC只是一种分离技术，能提供的蛋白质信息比较有限，HPLC-MS联用则结合了两者的优点，不仅可以对蛋白质做到快速的定性定量分析，还可以获得蛋白质的分子质量和结构信息等，增强了蛋白质指纹图谱的代表性[41].此外，HPLC-MS在多肽分析方面更是有独到的优势，有学者提出用肽质量指纹图谱[36]鉴别蛋白质或食品.这种基于特征多肽的蛋白质鉴定思路是：先提取样品中的蛋白质，将蛋白质进行酶解，得到多肽，经过高效液相色谱-高分辨率质谱检测，并与蛋白质数据库比对，筛选得到特征多肽，再通过HPLC-QQQ-MS和多反应监测方法得到特征多肽的总离子流图谱进行验证.Wong等[42]以HPLC-MS联用法分析了不同品种和来源的燕窝及其掺假品的多肽指纹图谱，其结果表明燕窝正品与掺假品多肽指纹图谱差异显著，并鉴定出燕窝中的两种主要生物标记蛋白：Muc-5AC蛋白和AMCase蛋白.张淑霞等[43]结合HPLC-Q-Exactive-HRMS和HPLC-QQQ-MS筛选得到核桃、杏仁、大豆、花生的特征多肽，经过验证，这种基于特征多肽的方法可以鉴别出核桃露、杏仁露中是否掺入了大豆或者花生蛋白，大豆和花生的最低检出限分别为：1.3和6.8 mg/kg，具有较高的灵敏度.这为蛋白基食品的多肽指纹图谱的构建提供了参考.

蛋白质指纹图谱的准确性，取决于蛋白质在色谱中分离的效率.近年来，一些新型的HPLC技术已经发展起来，例如超高效液相色谱（UPLC），它具有比HPLC更好的分离效率和分辨率，在检测领域上的应用逐年增多.Lu等[44]采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）构建了牛奶的多肽指纹图谱，可以区分牛奶是否掺入了植物蛋白，准确率达到95%.液体牛奶和奶粉的蛋白质种类相似，当往牛奶中掺入奶粉，则很难被检测出来，Du等[45]则建立了一种用UPLC-QTOF-MS检测液体牛奶是否掺入奶粉的方法，其通过比较两者的完整蛋白质指纹图谱和肽指纹图谱进行区分.此外，还有二维及多维HPLC-MS联用技术，例如凝胶过滤色谱-HPLC-MS/MS技术.多维HPLC-MS具有更高的分辨率，峰容量的优点，可以实现对蛋白质的精确检测，这对于食品蛋白质指纹图谱的构建来说是非常有用的工具.

2.2 高效薄层色谱-质谱联用法（HPTLC-MS）

高效薄层色谱（High performance thin layer chromatography，HPTLC）是采用特制的高效薄层板以及多级展开或分级展开等展开技术来提高薄层色谱的灵敏度和准确性的方法.如今HPTLC已具有数字扫描和自动化的优点，并且开发出可以直接从HPTLC板上洗脱样品到质谱仪上的装置——CAMAG[46]，使得HPTLC-MS联用成为可能.Sherma[46]报道了一种使用HPTLC-ESI-MS/MS方法建立葡萄酒中酪蛋白和卵清蛋白酶解多肽的指纹图谱，用以快速识别葡萄酒中是否含有过敏原.Esparza等[47]直接在TLC板上对α-氨基酸进行固定电荷衍生，再进行MALDI-MS分析，得到各α-氨基酸的Rf值色谱图和质谱图.结果表明，不同α-氨基酸均得到良好的分离，且这种衍生化后再进行MS分析方法的灵敏度很高，可以用于膳食中的氨基酸甚至寡肽的检测.以上研究表明HPTLC-MS在蛋白质类的研究中具有较大的潜力，可以运用到食品中的蛋白质指纹图谱的构建.

2.3 高速逆流色谱-质谱法（HSCCC-MS）

高速逆流色谱（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）利用流体动力学原理，通过控制螺旋管的方向与高速同步行星式运动产生一个二维力场，使相对移动的互不相溶的两相（一相作为固定相，另一相作为流动相）在高速旋转下实现高效的萃取频率，最后使样品组分按照不同的分配系数依次分离.HSCCC在天然产物的分离纯化方面应用较多，由于其无不可逆吸附、无需色谱柱和能有效保护活性物质的优点，近年来在蛋白质和多肽分离纯化研究方面的应用逐渐增多[48]，HSCCC-MS的联用能够更全面的分析蛋白质和多肽.Dong等[49]采用MCI凝胶柱层析-HSCCC-电喷雾高分辨串联质谱法，从球蛋白多肽中分离纯化得到高浓度的val-val-tyr-pro活性多肽.Li等[50]人利用HSCCC的反胶束溶剂体系来分离纯化苦瓜中的蛋白质.MALDI-TOF/TOF-MS/MS成功鉴定出3种蛋白质（抗性蛋白P-B、五肽重复序列蛋白和具有抗癌作用的新型蛋白）.HSCCC的快速纯化能力能够满足MS对蛋白质样品纯度的要求，两者联用可以实现快速对蛋白质进行鉴定，这对食品中蛋白质的分析以及蛋白质指纹图谱的建立方面具有很大的应用潜力.

2.4 高效毛细管电泳（HPCE）

高效毛细管电泳（High performance capillary electrophoresis，HPCE）是一种以高压电场为推动力，毛细管为分离通道，根据样品各组分之间的淌度和分配行为的差异进行分离分析的方法，其结合了色谱和电泳两种分离技术的优点.广泛应用于蛋白质类药物、生物液体蛋白质、食品蛋白质、农产品蛋白质的分析和质量控制等多个方面[51].张政等[52]人建立了以25个共有峰为代表的全蝎酶解液蛋白类成分（＞10 kDa）的HPCE指纹图谱，可用于鉴别全蝎蛋白类成分.李克宏等[53]建立了不同产地核桃、杏仁、大豆、花生的HPCE蛋白质指纹图谱，可作为掺假检测.Bonke等[54]通过HPCE对新型植物蛋白饮料中的氨基酸和蛋白质组成进行了分析，可鉴定单一和混合型植物饮料.HPCE分析不需要大量有机试剂，且操作简单快速，还可以同时分析多个样品，节省时间成本，在高通量蛋白质分析领域上有着良好的应用前景.

综上所述，光谱指纹图谱技术和色谱指纹图谱技术均适用于食品蛋白质的分析，两者各有优点和不足（如表1）.而从近年来的发展趋势看，多种技术的联用将是构建食品蛋白质指纹图谱的更好方法，能够得到更全面的蛋白质信息，更能反映食品品质的变化，有助于食品生产过程中的质量控制.

表1 光谱法与色谱法指纹图谱技术的比较

3 化学计量学在指纹图谱方面的应用

化学计量学是一门通过统计学或数学方法将对化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系的学科.它通过从相关和不相关的化学数据集合中提取有意义的信息来实现客观的数据评估，这为光谱和色谱的数据分析提供了强有力的工具[55].在化学计量学中，有二个重要的组成部分，分别是相似度分析和多元统计分析.

3.1 相似度分析方法

相似度算法是一类用于评价多个样本的向量或矩阵之间相似程度的算法总称.包括夹角余弦法（inter-angle-cosine；vector cosine）[56]、相关系数法（correlation coefficient）[57]、重叠率系数法（overlap ratio coefficient）、最大-最小系数法（min-max coefficient）、欧氏距离法（euclidean distance analysis）[58]、马氏距离法（mahalanobis distance analysis）[59]等.付江波等[56]对10批不同产地的藏药八味秦皮丸的XRD指纹图谱进行了相似度分析，分别采用了夹角余弦法和相关系数法计算该批样品的相似度，结果表明采用夹角余弦法进行评价更为准确，可用于八味秦皮丸的鉴定和质量分析.

3.2 多元统计分析方法

多元统计分析方法在指纹图谱的分析中应用最为广泛，它能够对样品指纹图谱进行综合分析、特征剖析和数据挖掘.根据分析原理，可分为有监督分析方法和无监督分析方法.

3.2.1 无监督分析方法

无监督分析方法，其目的是得到样品之间的聚类或分组关系，在不知道样品类别的情况下，常使用该法将复杂的图谱数据以分类树或图的形式转换出来进行分析.在无监督方法中，主成分分析（PCA）是应用最为广泛的分析方法，其他还有聚类分析（CA）、层次聚类（HCA）[60]、K-均值聚类（K-means）[61]、自组织映射人工神经网络（SOM-ANN）[62]等.荣菡等[62]采用偏最小二乘法（PLS）和SOM-ANN法联用，对牛乳和掺假乳的近红外光谱指纹图谱进行了分析和预测，SOM-ANN模型对未知样品的识别准确率达到了95%，并将样品分为了4类.表明SOM-ANN模型可用于食品的掺假鉴别.

3.2.2 有监督分析方法

有监督分析方法是指通过利用已知类别的样本作为训练集，进而建立分类模型，再使用模型对未知样品进行预测、归类的方法.这其中较为常用的有：线性判别分析（LDA）[63]、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）[45]、K最近邻法（K-NN）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）[31]、簇类独立软模式分类法（SIMCA）[64]、人工神经网络法（ANN）[65]、小波神经网络法（WNN）、典型相关分析（CCA）[66]、支持向量机（SVM）[67]、贝叶斯判别法（Bayes-DA）、反向传播人工神经网络（BP-ANN）[68]等.

指纹图谱可以说是反映分析样品复杂化学成分的特征曲线，相比于其他检测方法，其具有更大的信息量.化学计量学作为一种多变量数据分析工具，在处理整合大量信息方面有独到的优势.因此将食品蛋白质指纹图谱与化学计量学相结合，能够挖掘到更多有用的信息，在蛋白质食品掺假、溯源、品质鉴定、生产监测等方面将发挥巨大的作用.

4 结语及展望

蛋白质作为食品不可缺少的营养成分，在食品的生产过程中能够保持相对稳定，且具有物种特异性，非常适合作为生物标志物.目前蛋白质指纹图谱技术已广泛用于物种鉴定、疾病诊断、药物筛选、中药指纹图谱、食品质量控制等方面，已有20多年的发展历史，尤其是近年来，随着各种新型仪器和分析方法的涌现，各种蛋白质指纹图谱技术不断被开发用于食品安全和质量控制，可以预见，未来的食品安全和质量标准体系中必有蛋白质指纹图谱的一席之地，这将有助于建立一个更加规范化、标准化的食品认证和监管体系.

为了更好的促进食品蛋白质指纹图谱的发展，在此提出几点建议：1.决定蛋白质指纹图谱好坏的最关键一步是蛋白质提取技术，如何能够快速并且高效的提取到蛋白质，涉及到缩短蛋白质指纹图谱的时间成本和提高检测效率.因此需要进一步开发简便而有效的蛋白质提取技术，以实现实时无损快速检测；2.食品蛋白质在整个生产过程中会有一定程度的变化，这是一个动态变化的过程，单从产品角度制作的蛋白质指纹图谱已显不足，应开发蛋白质动态指纹图谱技术，用于追踪食品的整个生产、销售环节，这将会使食品的生产过程更加规范和标准化.3.建立蛋白质数据库共享平台，有助于提升蛋白质鉴定的效率.蛋白质指纹图谱不仅可以用于食品安全和质量控制，也可以用于发现新的蛋白质和活性物质，进一步提高食品的附加值.