基于糖基化抑制和诱导内质网应激的衣霉素抗肿瘤耐药研究进展

胡晓妍，李冠武

（汕头大学医学院肿瘤分子生物学开放实验室，广东 汕头 515041）

衣霉素是一种含有葡萄糖胺的嘧啶核苷类抗生素，具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤的特性，是常用的N-糖基化抑制剂和内质网应激诱导剂.衣霉素可以抑制N-乙酰葡糖胺1-磷酸转移酶，阻止真核细胞内质网中UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）向磷酸多萜醇转移，抑制N-寡糖的合成，影响蛋白质构象，最终导致未折叠蛋白质聚积于内质网，触发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[1].衣霉素也可以通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）信号通路，触发内质网应激.衣霉素在靶向多种糖蛋白和拮抗耐药性方面有很大优势，可能提高肿瘤细胞对治疗的敏感性.

1 异常糖基化促进肿瘤发展

糖基化是糖与其他糖类、蛋白质或脂质生成糖苷键的酶促过程，是一种重要的翻译后修饰，在蛋白质折叠、蛋白质稳定性、亚细胞定位和糖蛋白功能等方面有重要作用.相对于正常细胞，肿瘤细胞表现出广泛的糖基化改变[2].异常糖基化是细胞复杂聚糖合成受损、产生异常结构的过程，与癌症的发生、进展、转移和化学耐药性紧密联系[3].目前发现与癌症相关的糖基化有唾液酸化作用、岩藻糖基化、O-聚糖截断和N-糖基化和O-糖基化等[4].

糖基化是细胞促进和调节蛋白质折叠和质量控制的重要方式.新合成的未折叠蛋白质在内质网进行糖基化，糖蛋白上的聚糖链通过天冬酰胺的酰胺基，或通过丝氨酸或苏氨酸的羟基与多肽链共价相连，分别为N-糖基化和O-糖基化[3].N-糖基化参与蛋白质折叠和质量控制，N-聚糖为精确指导蛋白质底物折叠和质量控制系统提供模板.N-糖基化合成途径中，焦磷酸多萜醇供体上的寡糖GlcNAc等作为预装组件前体，被转移到粗面内质网上的新生多肽NXS/T（X为脯氨酸外的任意氨基酸）共有序列的天冬酰胺残基上[5].肿瘤细胞表面N-寡糖改变，与细胞增殖、迁移和侵袭特性有关[6].

糖基化是重要的肿瘤生物标志物，应用于临床检测癌症，如糖链抗原（casbohydrateantigen19-9，CA19-9）和癌胚抗原（carcino-embryonicantigen，CEA）糖蛋白是监测结直肠癌进展和复发的血清生物标志物[7].细胞表面N-糖基化的表达升高已被证明与肿瘤耐药相关，抑制其糖基化一定程度上能够拮抗耐药，如N-糖基化抑制提高多药耐药的卵巢癌对长春新碱、阿霉素和顺铂的敏感性[8]，抑制糖基化提高乳腺癌对阿霉素的敏感性[9].衣霉素抑制多种肿瘤中的N-糖基化，可能逆转现有抗肿瘤药物的耐药性，重新定位药物的应用范围.

2 内质网应激诱导影响肿瘤发展

内质网是真核细胞内膜系统的重要组成部分，蛋白质折叠和翻译后修饰主要发生在内质网，并受严格的质量控制.细胞应激及任何影响内质网功能的因素都可能导致错误折叠蛋白聚集，发生未折叠蛋白反应，触发内质网应激[10].内质网应激下，UPR信号转导程序的三条通路相互平行，分别由三个内质网跨膜受体介导：双链RNA激活蛋白激酶样内质网激酶（double-stranded RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、内质网跨膜蛋白需肌醇酶1a（inositol-requiring enzyme 1，IRE1a）和转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）[11].这些分子有广泛相似的激活机制，调节许多独特或共有的内质网应激反应过程.正常状态下，它们都与葡萄糖调节蛋白（glucose-regulated protein 78，GRP78）结合，呈单体和非活性状态，应激状态下GRP78分离.随后，PERK通过自身磷酸化激活，进而磷酸化真核起始因子，增加转录激活因子（Activating Transcription Factor 4）翻译，调节基因表达，减少蛋白质合成.IRE1获得内切核糖核酸酶活性，导致X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）mRNA剪切产生转录因子XBP1s.ATF6转移至高尔基体，裂解并释放转录因子的胞质结构域[12].这些信号通路相互强化，执行适应性程序，减少翻译起始（IRE1和ATF6介导）和选择性抑制特定mRNA翻译（PERK介导），纠正蛋白质折叠错误，恢复内质网稳态.适应不良的UPR不可逆转内质网应激，而是激活UPR依赖的凋亡通路，如通过激活IRE1α介导的c-Jun氨基末端激酶（p-c-Jun N-terminal kinase，JNK），抑制抗凋亡的B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）活性，增强促凋亡蛋白（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）的功能，诱发细胞凋亡[13].肿瘤细胞能够逃避细胞凋亡途径，并在应激状态下生长.此外，内质网应激能触发自噬体形成[14].

一些研究表明衣霉素上调内质网应激，抑制肿瘤的发生和化疗耐药.也有观点认为，内质网应激传感器PERK、IRE1和ATF6持续激活，增强肿瘤细胞的致瘤性、转移能力、耐药性和血管生成，且内质网应激可能阻止机体保护性的抗肿瘤免疫[15].多种肿瘤细胞存在强烈的内质网应激反应，且内质网应激常与化疗耐药有关.虽然基因突变、血管生成不足、氧气和葡萄糖短缺、高复制和代谢需求可能导致活跃的UPR，但癌基因的表达也可能抑制内质网应激[16].肿瘤细胞也可能增强蛋白质复制能力，恢复稳态.衣霉素诱导的内质网应激在不同研究中结论不一致，可能与细胞自噬机制、涉及的信号通路、肿瘤细胞的种类及衣霉素的浓度有关.

3 衣霉素抗肿瘤及肿瘤耐药

3.1 衣霉素通过抑制EGFR糖基化影响肿瘤细胞增殖

糖基化的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）表达持久，而去糖基化的EGFR稳定性差.衣霉素可能诱导EGFR去糖基化，促使EGFR从胞膜转移至胞质，从而抑制下游磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）通路[1].乳腺癌细胞中，衣霉素下调EGFR受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族蛋白的表达[17]；头颈部鳞状细胞癌中，衣霉素抑制EGFR信号通路[1]，均抑制肿瘤细胞增殖.

3.2 衣霉素通过抑制PI3K/Akt、MAPK信号通路拮抗紫杉醇和曲妥珠单抗耐药

PI3K/Akt、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路是EGFR家族二聚体激活的关键信号通路，衣霉素对PI3K/Akt和MAPK通路的影响也和EGFR的糖基化抑制密切相关.

紫杉醇用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌，但易产生耐药性，其机制可能包括紫杉醇诱导的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和MAPK信号通路上调、PI3K/Akt和MAPK等细胞保护通路的激活、细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2通路的激活、细胞凋亡通路的改变等[18].Shengshi Huang等人发现，在乳腺癌细胞中，衣霉素降低AKT、ERK1/2、JNK和p38的蛋白表达水平和磷酸化水平，可能拮抗紫杉醇引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增加[19].

另一项研究表明衣霉素能够提高乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性[17].曲妥珠单抗用于治疗人类表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER）2过表达的乳腺癌，其耐药机制涉及EGFR/HER家族、PI3K/Akt通路、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族等多个交叉信号通路[20]，拮抗其耐药性难度较大.衣霉素降低乳腺癌细胞中EGFR、HER2、HER3及ERK1/2、AKT的蛋白表达和磷酸化水平，可能拮抗对曲妥珠单抗的耐药性.且相较于单一用药，衣霉素和曲妥珠单抗联用抑制PI3K/Akt和MAPK信号通路，显著抑制乳腺癌细胞生长，促进细胞凋亡[17].

MAPK和AKT的激活导致甲状腺未分化癌对放射性碘治疗反应不佳.衣霉素可能通过降低ERK和AKT磷酸化水平，下调MAPK和AKT信号通路，进而恢复肿瘤细胞甲状腺相关基因的表达和摄碘能力，增强放射性碘治疗疗效[21].衣霉素还降低甲状腺癌细胞的糖代谢水平[21].

3.3 衣霉素通过抑制PTX3糖基化拮抗顺铂耐药（Akt/NF-κB信号通路）

穿孔素-3（pentraxin3，PTX3）在多种肿瘤中表达上调，与肿瘤细胞增殖、转移、病理分级和药物敏感性有关.PTX3的N-糖基化调节PTX3的功能[22].顺铂可能通过增加PTX3的表达，减弱对肺癌的疗效.衣霉素通过使糖基化的PTX3去糖基化，进而抑制Akt/核转录因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）信号通路，阻止 NF-κB 激活相关的肿瘤转移，可能恢复肺癌细胞对顺铂的化学敏感性[23].两者联用抑制AKT激活和NF-κB磷酸化，增强顺铂对肺癌细胞的增殖和迁移的抑制作用[23].衣霉素也被发现可以通过Akt/NF-κB信号通路抑制乳腺癌细胞的生长和侵袭[24].

3.4 衣霉素通过抑制CD44的糖基化阻止肿瘤细胞迁移

细胞表面跨膜糖蛋白CD44通过结合透明质酸，参与干细胞特性的获得，是肿瘤干细胞标志物.CD44分子糖基化导致构象变化，可能影响其结合透明质酸的能力.衣霉素可能降低CD44糖基化水平，进而阻止头颈部鳞状细胞癌肿瘤干细胞成球[1].CD44糖基化也参与上皮-间充质转化，促使肿瘤细胞迁移.此外，衣霉素降低肝癌细胞的CD44s糖基化水平，下调CD44s-ERK1/2信号通路，同时阻断驱动上皮间质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）的转化生长因子（transforming growth factor beta，TGF-β）信号通路，抑制肝癌细胞上皮-间充质转化[25].

3.5 衣霉素通过激活STAT3促进肿瘤细胞增殖和免疫抑制

然而也有研究表明衣霉素可能有促进肿瘤发展的作用.信号转导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是多条肿瘤信号通路的交点，STAT3也与内质网应激相关，UPR通路中，IRE1和PERK激活STAT3.衣霉素诱导口腔鳞状细胞癌细胞和正常口腔黏膜角化细胞白介素-6（interleukin 6，IL6）受体基因上调，正常口腔黏膜角化细胞STAT3和白血病抑制因子受体蛋白表达更高.IL6等生长因子激活STAT3，STAT3上调MAPK通路和自身STAT3通路，可能促进肿瘤细胞增殖和转移，并产生免疫抑制因子，导致抗肿瘤免疫抑制[26].

3.6 衣霉素诱导内质网应激影响肿瘤发展和耐药产生

关于衣霉素诱导的内质网应激是否促进肿瘤发展和耐药产生存在争议.多药耐药的胃癌细胞对衣霉素的敏感性高于亲本细胞，原因可能为其糖基化异常，导致基础内质网应激水平更高.衣霉素通过抑制N-糖基化，进一步提高内质网应激水平，可能克服多药耐药胃癌细胞的化疗抗性[27].衣霉素通过此机制也抑制头颈部鳞状细胞癌的发展[1].而Yakin等人发现衣霉素诱导的内质网应激，上调UPR通路中的STAT3和抗凋亡蛋白，促使口腔鳞癌细胞存活[26].衣霉素通过增强内质网应激抗肿瘤的机制可能有赖于衣霉素的糖基化抑制作用，而非由于衣霉素通过未折叠蛋白反应，触发内质网应激的作用.

3.7 衣霉素通过调控GRP78影响肿瘤发展和耐药产生

衣霉素诱导的GRP78表达及上调内质网应激水平是否能抑制肿瘤发展尚不明确.GRP78也称免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP），是钙依赖的葡萄糖调节蛋白，也是内质网应激标记物，在多种肿瘤中过表达.研究发现在衣霉素处理的乳腺癌细胞中，GRP78表达量增加，上调内质网应激，抑制肿瘤细胞增殖[17，28].但在甲状腺癌中，衣霉素诱导的GRP78表达可能促进肿瘤的转移；GRP78表达下调则抑制衣霉素诱导的内质网应激，并可能逆转肿瘤细胞的转移能力[10].Lee等人也认为GRP78表达升高能增强肿瘤侵袭能力，促使耐药发生[29].关于GRP78是否表达于细胞表面也有不同观点.内质网应激水平对于不同肿瘤细胞的影响和作用机制还需进一步研究.

3.8 衣霉素促进肿瘤细胞凋亡

研究表明，衣霉素下调结肠癌细胞的ERK和JNK的表达和磷酸化，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，可能通过抑制线粒体凋亡信号通路促进结肠癌细胞凋亡，抑制肿瘤生长和侵袭性[30].此外，衣霉素上调促凋亡Bcl-2家族蛋白Bim和Bid（BH3-interacting domain death agonist），下调抗凋亡蛋白Bcl-xL（B-cell lymphoma extra large）和髓细胞白血病 1（Myeloid cell leukemia-1，MCL1），促进肝癌细胞凋亡[25].衣霉素和顺铂联用时减少AKT激活，抑制NF-κB磷酸化，诱导肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）α介导的肺癌细胞凋亡[23].衣霉素和紫杉醇联用也增强紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡[19].

3.9 衣霉素通过阻滞细胞周期抑制肿瘤细胞增殖

衣霉素显著抑制细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinase，CDK）1、CDK2，阻止结肠癌细胞进入DNA（deoxyribonucleic acid）合成期（S期）和分裂期（M期）[30].衣霉素升高细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p27蛋白，降低细胞周期蛋白D1，使乳腺癌细胞阻滞于静止期/DNA合成前期（G0/G1期）.衣霉素还可能诱导肝癌细胞DNA合成后期/分裂期（G2/M期）阻滞[25].

3.10 衣霉素通过恢复摄碘能力增强甲状腺癌对放射性碘治疗的反应性

人B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase B-Raf，BRAF）、神经营养受体酪氨酸激酶1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1，NTRK1）、RET（rearranged during transfection）等甲状腺相关基因的表达影响甲状腺癌细胞的摄碘能力，是放射性核素碘131治疗甲状腺癌的关键因素[31].甲状腺未分化癌的相关基因沉默，细胞丧失摄碘能力，导致对放射性碘治疗反应不佳.有研究表明，衣霉素恢复碘代谢相关基因表达，增加钠-碘同向转运体、甲状腺过氧化物酶等蛋白的表达，促进甲状腺癌细胞对放射性碘的摄取[21].相比于单用衣霉素或者碘131，两者联用显著抑制肿瘤生长[21].

4 自噬调控肿瘤细胞凋亡

自噬是一种进化上保守的细胞蛋白质降解系统，在减轻细胞异常蛋白积累方面发挥关键作用.自噬诱导形成双膜囊泡的自噬体，自噬体将细胞蛋白和细胞器转运至溶酶体降解和再利用，从而减轻内质网应激[32].内质网可以形成自噬体的膜[27].自噬的特征为细胞质空泡和自噬体形成、微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）裂解增加和Sequestosome 1（SQSTM1/p62）蛋白水平降低[33].自噬对维持内质网稳态至关重要，内质网应激也可诱导细胞自噬.PERK下游的激活转录因子4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）控制转录，诱导自噬小体形成，而IRE1阻止自噬激活[12].在一定应激状态下，自噬维持生物合成的稳态，避免或延迟死亡反应，具有细胞保护功能.SQSTM1与泛素化蛋白聚合物结合，然后经自噬降解；抑制自噬时，细胞内SQSTM1积累，泛素/蛋白酶体系统破坏，内质网和线粒体中未折叠蛋白积累，细胞对凋亡敏感[34].细胞损伤严重时，自噬促进凋亡[35]，如持续内质网应激或UPR延长活化会激活促凋亡的Bcl-2家族，导致线粒体凋亡；内质网应激诱导剂衣霉素促使LC3-I转化为LC3-II，诱导mTOR失活，进而下调AKT/mTOR通路[36]；内质网应激诱导IRE1/JNK/beclin-1调节的乳腺癌细胞自噬，进而诱导细胞凋亡[37].UPR的三条信号通路都对自噬有显著意义，UPR与自噬的细胞保护性作用可能促进肿瘤的耐药性，如衣霉素能诱导乳腺癌细胞自噬，使乳腺癌细胞对低浓度的衣霉素不敏感；降低乳腺癌细胞自噬水平则促进细胞凋亡[37].

5 衣霉素的毒副作用

衣霉素引起的内质网应激可能激活NF-κB介导的肝脏炎症途径，诱发非酒精性脂肪性肝炎[38].衣霉素对正常人体细胞中亦有生长抑制作用.正常胃上皮细胞系对衣霉素比肿瘤细胞系更敏感[27]，低表达HER2的正常乳腺细胞对衣霉素敏感[17].衣霉素非特异性抑制N-糖基化，也可能干扰糖相关代谢.Xiqian Han等人发现衣霉素的毒副作用是剂量依赖性的，即小剂量应用衣霉素可能是安全的[17].低剂量的衣霉素可能干扰乳腺癌EGFR家族及MAPK、PI3K/AKT通路，提高乳腺癌细胞GRP78表达水平，而不对肝组织产生明显影响[17].

6 总结

尽管有部分研究表明衣霉素诱导内质网应激，可能促进肿瘤进展，但是衣霉素通过抑制N-糖基化，显著增强多种肿瘤细胞的治疗敏感性.衣霉素降低多个信号通路中的关键糖蛋白分子的糖基化水平，如CD44、EGFR和PTX3，明显下调EGFR家族及其下游PI3K/Akt、MAPK信号通路，Akt/NF-κB信号通路等，促进细胞凋亡.内质网应激水平对肿瘤的影响较不明确，部分研究认为内质网应激可能诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖；也有证据显示内质网应激可能通过诱导自噬，增强肿瘤的侵袭性.衣霉素与化疗药物如紫杉醇、曲妥珠单抗、顺铂等联用时均逆转肿瘤细胞耐药，增加多药耐药胃癌细胞、肝癌细胞、甲状腺未分化癌细胞等的治疗敏感性，有望用于辅助治疗难治性肿瘤.衣霉素的细胞毒性作用大多表现为剂量依赖性，且缺乏特异性，用于抗肿瘤时对正常组织的毒副作用难以避免.减轻内质网应激、避免过度的未折叠蛋白反应可能缓解衣霉素导致的脂肪性肝炎[39-40]，但其机制是否影响衣霉素抗肿瘤特性需进一步的研究.