造血干细胞体外扩增

杨超逸

（内蒙古大学，内蒙古 呼和浩特 010021)

造血干细胞是一类能够自我更新并具有分化成所有造血谱系细胞潜能的成体干细胞。造血干细胞在机体内通过自我更新可以维持机体内自身数量稳定，成熟分化则支持机体的终身造血。上述干性功能的维持受特殊造血微环境的网络调控。除此之外造血干细胞具有移植在体内长期重建各系造血和免疫功能。而造血干细胞的主要来源分为骨髓血、外周血和脐带血、胎盘。造血干细胞移植是各种血液肿瘤、再生障碍性贫血症、重度地中海型贫血症以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病的根本治疗手段。HSCT是将自体或者异体供者的HSCs 移植入受者体内以进行长期重建各系造血功能和免疫系统。HSCT 主要包括骨髓移植、外周血干细胞移植、脐血干细胞移植。其中脐带血是上述三种方法中造血干细胞含量最为丰富的。尽管如此，一份脐带血存储的有核细胞也仅为3.0×108 左右，据了解，对应1公斤体重的人需要使用2.0×107 的脐带血有核细胞。因此一份脐带血造血干细胞仅能够支持体重在15 公斤左右的患者的移植治疗。患者体型较大会限制其使用，同时也会导致造血功能恢复时间的延长，感染等并发症发生率增高，患者移植相关死亡率增加。这也成为造血干细胞临床应用的一个主要瓶颈。为解决这一难题，科学家们致力于力求体外扩增HSCs 数量，挽救更多的血液病患者。体外长期扩增培养脐带血造血干细胞的研究日益受到重视，但是目前为止造血干细胞干性维持状态下体外有效扩增仍然是一个科学难题,在体外培养环境中很难获得大量扩增。近年来多项基础及转化研究发现，细胞生长因子混合物、与基质细胞共培养及加入小分子化合物激动剂等具有人脐带血造血干细胞体外扩增作用。

一、造血干细胞简述

造血干细胞是具有自我更新能力及分化为所有成熟造血细胞谱系潜能的多能成体干细胞。HSCs 位于造血系统级联的顶端,在造血细胞谱系分化过程中,HSCs 首先失去自我更新能力,然后逐步丢失多能性,最终成为红细胞、血小板、粒细胞、DC 细胞、B 细胞、T 细胞及NK 细胞等有特定功能的成熟细胞类型。众多信号通路及调控因子的遗传学与表观遗传学网络型调控在HSCs 的命运决定、细胞死亡和存活、细胞分裂或静息、细胞分化或自我更新、极性和迁移或定居等各种生物学行为中起重要作用。正常的生理条件下,机体内HSCs 几乎不分裂,主要处于静息和休眠状态,只有一小部分HSCs 参与特定阶段的活跃的造血生成。

二、小分子化合物在造血干细胞调控中的研究进展

（一）小分子化合物的定义及其作用特点

小分子化合物指相对分子质量小于10000 的化合物。在干细胞体外培养中，一些小分子化合物显示了它们的独特优势。首先，化合物的作用效果可以通过调节化合物的结构、浓度来改变，其过程简单可控；其次，小分子化合物相较于细胞因子或转录因子等性质更为稳定，化合物的前期处理以及给药非常方便[5]。

（二）多糖类物质对造血干细胞的调控

多糖类物质可以在胰高血糖素的作用下影响HSCs 归巢等活动信号通路，如wnt／B.catenin 信号通路、P13K／AKT 信号通路和活mTOR 信号通路等的靶基因表达，进而于维持HSC自我更新能力，提高HSC的归巢能力，使HSC 显著扩增。

（三）GSK－3β 抑制剂BI0

其对HSC 细胞自我更新的影响可能是由于mTOR 信号通路的激活而受到抑制；c—MPL 小分子激动剂NR.101、5-氮脱氧胞苷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂都是通过减缓细胞周期进程，从而促进HSC 的自我更新.

（四）TEPA 铜螯合剂

可以螯合细胞内的铜离子，进而降低细胞内铜的水平，促进HSC 自我更新；丙戊酸(vPA)和二乙基氨基苯甲醛(DEAB)可抑制HSC 分化；SIRTl可以促进HSC 归巢；前列腺素E2(PGE2)、Caspase 抑制剂及钙蛋白酶抑制剂和血清素可以抑制HSC 凋亡。

（五）与氧化相关的小分子化合物对造血干细胞的调控

氧浓度是参与造血细胞发育微环境中的最主要的因素，低氧环境能够降低活性氧的产生，使HSC 处于静息状态，HSC 表达，从而更好地维持了HSC 的迁移能力。有文献报道，抗氧化剂可通过消除ROS 提高HSC 的功能，进而改善HSC 移植存活率。目前，已发现的与HSC 调控相关的抗氧化小分子有N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、DNA 甲基转移酶抑制剂TSA/5azad、SIRT1激动剂白藜芦醇、咖啡酸苯乙酯CAPE、丙戊酸VPA、尼克酰胺NAM、抗坏血酸磷脂酸盐AA2P 等。

（六）UM171

UM171 是一种高效的HSCs 再生小分子激动剂，可以增强人造血干/祖细胞的体外自我更新。UM171 对体外培养细胞的分裂速率没有影响，但可以促进细胞CD34+CD45RA-表型的维持，同时可以减少与红系和巨核细胞分化有关的转录因子的表达。最近研究发现，在经UM171 处理的细胞中，PROCR 基因显著上调。同时，UM171 在人类多能干细胞衍生造血祖细胞方面也具有巨大潜力。

三、氧气浓度对HSCs 体外扩增的影响

在HSCs 体外培养过程中，为了能更好地模拟体内环境，氧浓度和小分子物质是需要考虑到的重要影响因素。其中氧浓度是造血干细胞体外培养环境和体内造血微环境中的重要物化参数，常用的体外培养体系中的氧浓度一般可以高达21%，而体内骨髓造血微环境中的氧浓度只有1－6%左右，两者之间存在的这种显著差别有可能对造血干细胞的扩増、分化和生理功能产生重要影响。以往的研究已经证实，在体外某些特定的因子、信号能有效地促进HSCs 的扩增和自我更新。研究发现可以通过在培养基中添加小分子生物或者化学物质来调节HSCs 的功能。周立萍博士的研究团队选择在CD34+细胞培养基中添加睾酮，肾上腺素，去甲肾上腺素这三种小分子物质，并同时在常氧（20%）和低氧（1%）两种氧浓度下培养，来观察比较激素＋不同氧浓度这两者相结合对HSCs 扩增，细胞表型，基因表达的影响，以此来探讨一种更好的HSCs 体外培养条件。

四、模拟HSCs 骨髓微环境

（一）造血干细胞微环境

造血干细胞微环境是位于血管周围靠近骨小梁区，由骨髓间充质基质细胞及内皮细胞组成的维持和调节HSCs 生理功能的局部组织微环境。在Niche 中，Niche 细胞通过粘附分子和膜表面信号分子来与HSCs 直接或间接接触进而调控HSCs 的自我更新、增殖、分化等一系列生物学行为。[22]

（二）骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞，既往称为骨髓基质成纤维细胞,是一类起源于中胚层的成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,可分化为多种间质组织,如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。骨髓BMSC 的迁移、定植、增殖与分化,需要从外界获取信息。其分化方向取决于所在的微环境。这里的“微环境”不仅包括骨髓微环境,还包括局部间质组织微环境。PMF患者骨髓微环境改变有:间质细胞增多及发育异常的巨核细胞聚集、细胞外基质蛋白增加,血管生成增加,窦状隙扩张伴血管内造血,骨硬化等。这种改变呈片状分布,不同患者或同一患者不同部位骨髓改变有所不同。局部间质组织微环境涉及多种因素骨髓基质蛋白,细胞间、细胞与基质间接触,局部细胞、生长因子浓度及受体表达情况等。AMM 患者骨髓成纤维细胞是否由骨髓BMSC 分化而来，尚未明确。但研究发现骨髓微环境、BMSC 及造血干细胞间存在极其微妙的关系,这可能与PMF 发病有关。

（三）BMCS+细胞因子模拟骨髓微环境

目前已经确定的能在体外有效扩增HSCs 的方法是在培养基中添加多种固定组合的造血细胞因子，能使HSCs 数量明显增加，但扩增所得HSCs往往失掉了长期造血和重建免疫的功能。BMSC 是造血微环境中的重要组成部分，通过分泌多种造血细胞因子调节造血系统，维持HSCs 的稳定和功能，促进其扩增，增强其自我更新能力。

细胞因子组合和BMSC 的联合应用使造血细胞明显扩增，增殖迅速，且CD34+HSCs 的比例也明显多于单独使用细胞因子;同时，集落分析实验显示，以这种方式扩增的HSCs 在体外具有很强的集落形成能力，具有分化为各系造血细胞的能力。这表明MSCs 条件培养基和细胞因子组合相辅相承，条件培养基中丰富的细胞因子更进一步加强了细胞因子组合的扩增效应，同时也一定程度上维持了HSCs 的稳定和功能。

五、表观遗传学修饰剂

造血干细胞的自我更新和分化受到高度协调的表观遗传调控，其中组蛋白乙酰化修饰可以激活或沉默基因的转录。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以抑制造血干细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性，增加组蛋白乙酰化水平。多种HDACIs，如曲古他汀A、丙戊酸钠等，被用于在体外无血清培养中与细胞因子组合联合处理造血干细胞，尤其是脐血造血干细胞，促进与干细胞自我更新相关的多能基因的转录表达，抑制分化相关基因的表达，从而促进造血干细胞扩增，抑制分化，获得数量更多的长期重建细胞。

HDACIs 可以上调将早期HPCs 重编程为HSCs 的基因表达，这些与HSCs扩增和功能维持有关的基因在HSCs 培养过程中被沉默，组蛋白乙酰化能促进这些基因表达。

羧酸类 HDACI 丙戊酸抑制类和a 类HDACs，能使CB-CD34+细胞表观重编程，促进CB-HSCs 扩增。研究发现，含血清培养体系下VPA 处理HSCs 产生更多分化细胞，即大量祖细胞和短期重建细胞而非长期重建细胞。

六、小结

综上所述小分子化合物诱导干细胞分化，对治疗神经系统疾病、糖尿病、成骨缺损等复杂的疾病有一定的临床应用，以及在HSC 和白血病干细胞的调控中有着重大的作用。小分子化合物对促进HSC 的增殖以及调控白血病干细胞有着比较乐观的应用前景，相比于细胞因子来讲,小分子化合物具有来源易得,结构明了,作用靶点和机制容易深入研究的优势。发现更多安全可靠的、无毒副作用的，可体外扩增HSC 或调控白血病干细胞的小分子化合物，对于解决人类的血液疾病及其他的一些疾病有着重大的意义。