蔬菜水果中藜芦碱残留量检测方法的研究

李 娜， 张碧宇， 陈鑫兰， 隋玉杰

（1. 浙江义谱检验检测技术服务有限公司， 浙江 温州 325000；2. 温州市质量技术检测科学研究院， 浙江 温州 325000； 3. 温州市食品药品检验科学研究院， 浙江 温州 325028）

0 引言

藜芦生物碱（Veratrine） 是一种以藜芦定（Veratrdine） 、 藜 芦 胺 （ Veratramine） 和 蒜 藜 芦 碱（Jervine） 为主的混合生物碱， 提取自我国盛产的百合科多年生草本植物藜芦， 其作用机制与氯化烟酰类农药相似， 具有触杀和毒胃作用， 对昆虫类害虫有一定的抑制生长和灭杀作用， 可防治棉蚜、 玉米螟、 水稻潜叶蝇、 柑橘叶螨等多种作物害虫。 藜芦碱提取于自然植物， 一般认为环境相容性较好， 近年来在蔬菜水果农药中的应用逐渐广泛， 藜芦碱的登记数量与产量也不断增加。 虽然藜芦碱是一种植物源杀虫剂， 但对人的神经系统、 呼吸系统、 心血管系统、 消化系统、 生殖系统都有一定的毒性作用，严重时可引发痉挛抽搐、 呼吸暂停、 心律失常， 胚胎畸形等。 目前， 在食品领域还未出台相关检测标准， 但在化妆品领域已经在《 化妆品安全技术规范》（2015 版） 中将藜芦碱及其盐类列入了禁用名单[1]。

采用超高效液相色谱- 质谱/ 质谱联用法（ UPLC-MS/MS） 检测蔬菜水果中藜芦碱残留量， 通过对不同蔬菜水果中藜芦碱的萃取溶剂、 提取方法、净化方法及色谱质谱条件进行研究， 确定前处理方法及仪器方法， 建立一个操作性强、 适应性广、 检测效率高的检测方法， 准确评价蔬菜水果中藜芦碱残留量的含量， 并对温州地区市售不同蔬菜水果进行检测，达到有效监管， 从而更好地维护消费者的健康。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

藜芦定（ Veratridine， 71-62-5， 99.7%） ， 藜芦胺（ Veratramine， 60-70-80， 100%） ， 蒜 藜 芦 碱（ 469-59-0， Jervine， 98.5%） 标准物质， 德国Dr.Ehrenstorfer 公司提供； 乙酸乙酯、 正己烷、 乙腈、甲酸、 无水乙醇均为色谱纯； 试验用水为超纯水。

超高效液相色谱- 质谱/ 质谱联用（ UPLCMS/MS） ； GCB/NH2SPE 固相萃取柱， 500 mg， 6 mL，上海安谱实验科技股份有限公司产品； Florisil SPE固相萃取柱1 g， 6 mL， 上海安谱实验科技股份有限公司产品； QuECHERS Clean-up Kit， 900 mg MgSO4+150 mg PSA+15 mg GCB， 15mL， 北京隆年达信科贸有限公司产品； 5430R 型高速冷冻离心机， 德国Eppendorf 公司产品。

1.2 试验样品及试验条件

1.2.1 试验样品

苹果、 梨、 橘子、 青菜、 青椒等均为市售的水果蔬菜。

1.2.2 QuEChERS 前处理方法[2]

称取10 g 试样， 精确至0.01 g， 置于50 mL 离心管中， 加入10 mL 乙腈、 4 g 硫酸镁、 1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠、 0.5 g 柠檬酸氢二钠， 均质1 min 后以转速4 200 r/min 离心5 min， 吸取6 mL 上清液加到装有900 mg 硫酸镁及150 mg PSA 的15 mL 塑料离心管中： 对于颜色比较深的试样在15 mL 离心管中加入885 mg 硫酸镁、 150 mg PSA 及15 mg GCB， 旋涡混匀1 min。 以转速4 200 r/min 离心5 min， 准确移取上清液2 mL 于10 mL 离心管中， 40 ℃下水浴氮吹至近干， 加入甲醇1 mL 复溶， 过0.22 μm 滤膜， 待仪器进样测定。

1.3 样品的制备

水果、 蔬菜样品取样部位按GB 2763 附录A 执行， 将样品切碎混匀均一化制成匀浆， 制备好的试样均分成2 份， 装入洁净的盛样容器内， 密封并标明标记。 将试样于-18 ℃冷冻保存。

1.4 色谱测定

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱： Eclipse Plus C18RRDH 1.8 μm， 2.1×50 mm， 柱温： 35 ℃， 流速： 0.2 mL/min， 进样量：2.0 μL， 流动相A： 甲醇（0.1%甲酸， 5 mmol/L 乙酸铵）， 流动相B： 水（0.1%甲酸， 5 mmol/L 乙酸铵）。

梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.4.2 质谱条件

离子源： 电喷雾离子源， 扫描方式： 正离子扫描， 检测方式： 多反应监测（ MRM） ， 电喷雾电压1 750 V， 辅助气温度300 ℃。

定性离子对、 定量离子对、 裂解电压及碰撞能量见表2。

表2 定性离子对、 定量离子对、 裂解电压及碰撞能量

2 结果与分析

2.1 标准曲线、 回收率和精密度

配制不同质量浓度的藜芦碱标准溶液， 以峰面积为Y 轴， 质量浓度为X 轴， 绘制标准曲线， 线性范围10～500 ng/mL， 标准曲线的线性良好（R2＞0.995） 。 分别在空白果蔬中添加0.005， 0.010， 0.050 mg/kg 3 个质量浓度标准品， 回收率范围为81.3%～102.5%， 其相对标准偏差（RSD） 的范围为2.2%～5.6%， 表明该方法稳定可靠[3]。

不同样品加标回收率和精密度见表3。

表3 不同样品加标回收率和精密度

2.2 不同样品中藜芦碱残留的含量

每种蔬菜水果检测20 个批次。

不同样品中藜芦碱残留的含量见表4。

表4 不同样品中藜芦碱残留的含量/mg·kg-1

由表4 可知， 藜芦碱在蔬菜水果中的具有一定的检出率。

3 试验开发

3.1 不同提取试剂对试验回收率的影响

不同提取试剂对试验回收率的影响见表5。

表5 不同提取试剂对试验回收率的影响

由表5 可知， 选用乙腈提取为最佳方法。

3.2 不同净化小柱对回收率的影响

不同净化小柱试验的回收率见表6。

由表6 可知， 选用QuECHERS Clean-up Kit 净化萃取液回收率较高， 实际操作也较为简便， 故选用QuECHERS Clean-up Kit 作为净化方法。

表6 不同净化小柱试验的回收率

3.3 不同复溶溶剂对回收率的影响

不同复溶溶剂的回收率表7。

由表7 可知， 不同复溶溶剂的回收率相差不大，相对而言， 已使用甲醇复溶的回收率较高， 又与仪器进样流动相相同， 所以选用甲醇作为复溶溶剂。

表7 不同复溶溶剂的回收率

4 结论

通过对不同蔬菜水果中藜芦碱的萃取溶剂、 提取方法、 净化方法进行研究， 确定前处理方法及创建最佳色谱质谱条件。 结果表明， 选用乙腈为萃取试剂， 使用QuECHERS Clean-up Kit 作为净化方法，选用甲醇作为复溶溶剂为最佳前处理方法。 以市场购买的样品检测结果得出， 市售的蔬菜水果部分有检出， 因此有必要对蔬菜水果进行藜芦碱的监测，达到有效监管， 更好地维护消费者的健康。