热休克蛋白90联合甲胎蛋白在肝细胞癌早期诊断中的价值

阎春英,付佐君,刘贵生,李 江,孙晨曦

阎春英,付佐君,刘贵生,孙晨曦,陕西省人民医院消化内一科 陕西省西安市 710000

李江,陕西省人民医院肿瘤外科 陕西省西安市 710000

0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第六大常见癌症,被认为是男性癌症诱导死亡的第二大原因,女性第六大原因[1].在中国,每年有78000余人死于肝细胞癌[2].目前,HCC患者的治疗选择有限,只有10%-20%的病例可以通过手术治愈,并且术后复发率较高.对于肝癌患者来说,敏感、准确和及时的诊断是解决这一令人头疼的难题的关键[3].因此,HCC早期诊断成为HCC预后的最重要一步[4].开发具有更好诊断性能的HCC血清标志物成为肝细胞癌提高诊断准确率的重要方式[5].近年来,热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)已成为肿瘤研究的热点,它在调节肿瘤细胞信号转导中起关键作用,是一种进化上高度保守的细胞内分子伴侣[6].由HSP90α、HSP90β、葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94,Grp94)和肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptorrelated protein1,TRAP1)四个成员组成[7].此篇研究旨在比较甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)与HSP90在诊断肝癌方面的利弊,设计临床试验评估血清HSP90对HCC的诊断准确性,或联合AFP提高HCC诊断价值.

1 材料和方法

1.1 材料 本研究选取2017-08/2020-07于陕西省人民医院的住院患者及体检中心健康者,共348例患者,其中肝细胞癌患者191位,肝硬化患者157位,健康对照者35位(健康体检者HBV HCV均阴性).纳入实验患者及健康对照组均已签署知情同意书,并通过伦理审批.纳入标准:肝病诊断标准符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会,肝病学分会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎诊断标准.肝硬化诊断符合《2019版中华医学会肝病学分会:肝硬化诊治指南》[8],肝细胞癌诊断包括影像学及血清学及病理学诊断标准,分期依照《原发性肝癌诊疗规范》[9].健康对组肝功正常,排除肝炎,肝硬化,并排除胃肠道肿瘤,胆胰,生殖系统及其他系统恶性肿瘤患者.

1.2 方法空腹采集外周血2 mL,无溶血、脂血,2000 r/min离心8 min,分离血清,-20 ℃保存,采用微粒子酶联免疫法测定血清AFP,(AB-BOTT AXSYM全自动免疫分析仪).采用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清HSP90.AFP＞7 ng/mL,Hsp90＞90 ng/mL为阳性表达.灵敏度=真阳性例数/HCC患者总数×100%;特异性=真阴性例数/HCC患者总数×100%;准确性=(真阳性例数+真阴性例数)/HCC患者总数×100%.

统计学处理数据处理及分析基于SPSS 22.0软件,均数比较采用方差分析.建立接受者操作特性曲线,进行计算血清AFP及血清HSP90诊断肝细胞癌敏感性及特异性,评估血清标志物诊断价值.P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 一般临床资料比较 纳入病例组及对照组共383例,其中病例组191例,对照组192例.应用SPSS Statistics 21对实验各组样本的一般临床资料进行统计学分析,纳入人群的基线特征及各血清标志物比较(表1,表2),计算AFP和HSP90对于肝细胞癌诊断价值(表3).

表1 纳入研究人群的基线特征及统计结果

2.2 亚组分析 本研究纳入383名受试者,分成以下亚组:(1)肝硬化早期组(Chlid-Pugh A级):纳入患者44例;(2)肝硬化中期组(Chlid-Pugh B级):纳入患者53例;(3)肝硬化晚期组(Chlid-Pugh C级):纳入患者60例;(4)肝细胞癌早期组(BCLC 0-A期):纳入患者140例;(5)肝细胞癌中期组(BCLC B期):纳入患者51例;(6)对照组:35名健康志愿者.图1显示,HSP90和AFP在肝硬化组与肝细胞癌组中浓度变化趋势,肝硬化晚期组与肝细胞癌早期组及肝细胞癌中期组浓度变化显著,相比于血清AFP,血清HSP90浓度随着疾病的进展过程中变化更加线性,更加符合早期诊断的要求.

图1 疾病由肝硬化发展为肝细胞癌的变化过程中血清AFP及血清HSP90的浓度变化情况.A:HSP90在肝硬化组(A B C)、肝癌早中期(BCLC 0-A B)及健康体检对照组中浓度水平变化;B:AFP在肝硬化组(A B C)、肝癌早中期(BCLC 0-A B)及健康体检对照组中浓度水平变化.肝硬化组(A B C):肝硬化Chlid-Pugh分期;HCC(BCLC 0-A B):肝细胞癌巴萨罗那分期.HSP90:热休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白;HCC:肝细胞癌.

2.3 以AFP、HSP90及性别作为联合诊断指标可提高肝细胞癌诊断准确率 利用ROC曲线分析各组间中血清AFP、HSP90水平变化及年龄和性别变化(图2).其中AFP的截断值(约登指数最大值)为0.429,对应灵敏度为61.5%,特异度为86.2%;HSP90的截断值(约登指数最大值)为0.531,对应灵敏度为82.5%,特异度为70.4%.

图2 纳入实验人群中HSP90、AFP及性别、年龄对于肝细胞癌诊断的ROC曲线图.HSP90:热休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白.

HCC诊断模型的构建:以肝病状态(HCC组,非HCC组)为应变量,血清AFP、HSP90、性别、年龄、肝功水平测定结果为自变量,建立Logistic回归模型.获得HCC诊断概率预测模型HCC(P)=-4.555+0.884X性别(男=1,女=0)+0.157×AFP+0.25×HSP90;该模型经过似然比检验,此回归模型具有统计学意义(P＜0.01),以预测变量PRE为检验变量,诊断结果为状态变量,做AFP,HSP90和性别三者联合的ROC曲线分析(图3).

图3 新型诊断模型以性别、AFP、HSP90作为联合诊断的ROC曲线图.HSP90:热休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白.

3 讨论

肝细胞肝癌最佳的手术时机是早期肝癌,但早期多无明显的症状、体征,发现时多数已为中晚期,总体5年生存率＜5%[10].AFP作为目前临床上诊断肝细胞癌应用最广泛的肿瘤标志物其敏感性及特异性均不令人满意.肝硬化结节,脂肪浸润,不典型肝脏炎性病灶及罕见的肝脏良性病变等均可发生AFP升高[11].目前,AFP作为应用最广泛的HCC血清标志物,主要有两个目的,一是评测HCC发生的风险,二是检测发现亚临床肝癌[12].对这种风险的准确评估,将HCC高危患者与低危患者区分开来,可以有效地降低代偿期肝硬化患者HCC发生风险评估的成本效益[13].然而,HCC患者血清AFP水平与地区、种族、ALT及病毒感染等因素有关,AFP不同诊断临界值其敏感性和特异性差别很大,并且认为对于肝硬化患者发生HCC,AFP的诊断及筛查价值很差[14].

近年来,随着肿瘤基因组学和蛋白质组学的发展,肝细胞癌诊断标志物的研究越来越多,目前广泛研究新型肝细胞癌标志物包括甲胎蛋白异质体(culinaris agglutinin A-reactive fraction of AFP,AFP-L3),高尔基体蛋白73(protein 73,GP73),脱-γ-羧基-凝血酶原(des-γcarboxy-prothrombin,DCP),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)等.然而上述血清标志物在研究中均发现存在敏感性不足的问题,尚不能替代甲胎蛋白成为肝癌血清学诊断的指标.研究证明,与常用的肿瘤生物标志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen21-1,CYFRA21-1)(肺癌)及AFP(肝癌)等相比,HSP90是一种更准确的诊断生物标志物[15].Sun等[16]使用差异蛋白质组学及酶联免疫吸附法分析证实HSP90对肝细胞癌的早期诊断和预后有一定意义.Fu等[17]在一项大样本、多中心临床试验中,发现HSP90诊断HCC的灵敏度可达92.7%,特异度为91.3%,提示HSP90在诊断AFP阴性的HCC中有较高价值.

肝癌的特点是男性发病率高于女性.肝癌的男女发病率在2:1到4:1之间变化.性别是肝癌的一个危险因素[18].本研究发现性别与HCC发生的相关性较年龄更为显著.因此,在血清学评估患者肝细胞癌发生率时,应当将性别纳入评估范围,这样较单一使用AFP数值评估具有更高的可信度.先前研究证明肝硬化患者和肝癌患者的AFP明显高于健康对照组.此外,HCC患者的AFP明显高于非HCC患者[19].然而,本研究发现,AFP的假阴性率较高,纳入肝细胞癌早期组(BCLC 0-A期)140位患者中111位患者AFP阴性(cut-off值为7 ng/mL);肝细胞癌中期组(BCLC B期)51位患者中6位患者AFP阴性(cut-off值为7 ng/mL).同时,HSP90作为新型肝细胞癌血清学标志物,本研究中,其对于HCC的敏感度为82.5%,特异度为70.4%,准确率为79.1%,相对于AFP有着独特的优势,但特异度较AFP稍低.本文旨在通过建立诊断模型,联合AFP、HSP90和性别指标,最大程度提高HCC诊断准确率,运用新的截断值量化患者罹患HCC风险.

本研究通过回顾性收集来自陕西省人民医院的肝硬化及肝细胞癌患者HSP90和AFP数值,通过分组比较肝硬化早、中、晚期及肝细胞癌早期和中期组中HSP90和AFP浓度差别,可得出HSP90和AFP对于肝细胞癌早期诊断都有一定的价值,从两种标志物联合提高诊断价值为切入点,应用逐步回归方法筛选诊断效能较高的联合检测模型,纳入该预测模型的指标是AFP、HSP90、性别、年龄,被剔除的模型是年龄、ALT、AST.将新型HCC诊断模型命名为SAH(Sex,AFP and HSP90).

如图3,图4,SAH作为HCC单独诊断的ROC曲线,其AUC为0.901,截断值(约登指数最大值)为0.614,对应灵敏度为87.8%,特异度为76.8%;相较于AFP或HSP90,SAH联合诊断不仅提高了诊断灵敏度,同时也有较高的特异度,亚组分析中随着SAH数值变化较AFP或HSP90单一数值变化更有阶段性并更显著.因此对于肝细胞癌的早期诊断具有临床意义.

图4 SAH(Sex,AFP,HSP90)联合诊断在肝硬化组(A B C)、肝癌早中期(HCC BCLC 0-A B)及健康体检对照组中浓度水平变化.肝硬化组(A B C):肝硬化Chlid-Pugh分期;HCC(BCLC 0-A B):肝细胞癌巴萨罗那分期.HSP90:热休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白;HCC:肝细胞癌.

随着HCC的早期诊断技术的发展,AFP呈阴性或低浓度的病例不断增多,为了提高HCC的诊断价值,联合其他肿瘤标志物诊断成为提高HCC诊断价值成为目前可行的方法[20].本研究证明AFP对于肝细胞癌早期诊断的准确率较低,假阴性率较高,通过回归分析建立诊断HCC模型证明HSP90可提高AFP阴性的肝细胞癌早期诊断价值,对于HCC的早期诊断具有重要意义.

4 结论

本研究表明,与肝硬化及健康对照组患者相比,肝细胞癌患者的HSP90水平显著升高.与AFP相比,HSP90对于肝细胞癌的诊断灵敏度更高.应用回归获得的预测模型诊断HCC时,敏感性显著提高.故此,AFP,HSP90联合检测效果优于AFP单独检测,能够提高肝癌早期诊断率.

本次研究存在一些局限性,例如数据来源于单中心,样本量较小,没有考虑地域及人种差异.因此,需要更深入、更严格的设计、大样本量、不同病因和多个协作中心的研究.

文章亮点

实验背景

甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)对于肝细胞癌诊断的准确率逐年降低,新型肝细胞癌诊断标志物研究深入,新老血清标志物的联合诊断成为提高诊断价值的重要方法.

实验动机

热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)与AFP联合诊断提高肝细胞癌诊断率.

实验目标

通过构建诊断模型,得出联合诊断可提高诊断敏感性和特异性.

实验方法

利用SPSS构建肝细胞癌新型诊断模型,得出诊断公式以证明联合诊断可提高诊断价值.

实验结果

AFP联合HSP90的肝细胞癌诊断灵敏度和特异度较二者单一诊断有了显著提升.

实验结论

新型诊断模型利用联合诊断公式有效提高了肝细胞癌诊断敏感性和特异性,对提高肝细胞癌诊断价值有更重要意义.

展望前景

本研究构建的新型肝细胞癌诊断模型可较少增加诊断成本的同时,极大提高诊断准确率,未来可通过多中心研究归纳统计结果,对结果的危险程度分级,对肝细胞癌的极早期诊断做出贡献.