响应面法优化清胃散水提工艺研究*

欧丽娜，郑晓丹，毛文伟，李云霞，王 珂，张奥攀，李 杰

（河南科技大学医学院，河南 洛阳 471000）

清胃散首载于李东垣《脾胃论》，是由升麻、黄连、当归、生地黄、牡丹皮5味中药组成，具有清胃凉血之功，主治胃中积热，牙痛牵引头痛，面颊发热，其齿喜冷恶热，或牙龈红肿溃烂，或唇舌腮颊肿痛，口气热臭，口干舌燥，舌红苔黄，脉滑数[1]。临床上常用于治疗口腔炎、牙髓炎[2]、牙周炎[3]等属胃火上攻者。传统用法为“水一盏半，煎至七分，去渣，放冷服之”。该方法携带不便且质量不可控，但目前并未有成药上市，亟待开发合适的剂型，补充临床所需。

响应面法适用于考察连续变量及非线性数据处理等问题。因此，笔者采用多指标分析，以方中君药黄连的主要成分盐酸小檗碱含量[4]及复方的出膏率为评价指标，采用Box-Behnken设计法，对其水提工艺进行优化研究，以期为清胃散制成现代剂型提供参考。

1 仪器和材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪（LC2000，上海天美科学仪器有限公司）；电子分析天平（FA2204B，上海精密科学仪器有限公司）；超声波清洗仪（KQ2200DE，昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（HH-4A，金坛市精达仪器制造有限公司）；真空干燥箱（02R-6030，上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 药物与试剂 黄连、升麻、生地黄、牡丹皮、当归等药材饮片均购于河南省洛阳市张仲景大药房股份有限公司。盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201613，中国食品药品检定研究院）；乙腈、磷酸、磷酸二氢钾为色谱纯，甲醇、十二烷基硫酸钠、硅藻土为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 提取方法 分别按照处方比例称取各药材饮片，粉碎过12目筛，按各试验设计量加入适宜体积倍数的纯净水，浸泡相应时间，加热回流提取相应时间及次数，4层纱布过滤，滤液合并，置恒温水浴锅浓缩成稠膏，备用。

2.2 出膏率测定方法 取各试验组稠膏，置于真空干燥箱105 ℃烘干3 h，移置干燥器中冷却30 min，迅速精密稳定质量，以干燥品重量与原药材重量比计算出膏率。

2.3 盐酸小檗碱的含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 固定相：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（45∶55，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm[5]；进样量：20 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.140 mg/mL的对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3.3 供试品溶液的制备 取“2.2”项下干膏适量，按照比例1∶1.5稀释。取稀释液1 mL与硅藻土2.5 g混匀，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，超声30 min，取上清液2 mL转移至10 mL容量瓶，甲醇盐酸溶液（100∶1）定容得到供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

位于瑞金西北隅冈面乡竹园村的中央苏区红军兵工厂，是在第五次反“围剿”战争初期，陆续从兴国、于都等地迁入的官田兵工厂、寨上杂械厂和银坑弹药厂等军工企业合并而成的。全厂六七百人的职工队伍中，就有来自江西、福建、广东、上海、沈阳各地的人。他们有的是自愿当红军来的，有的是被俘的国民党军人愿意留下来的，有的是经当地党组织动员或派遣来的。因而由乡土意识、生活习惯、思想觉悟等差异而产生的不团结现象时有发生，有时还因此影响了厂里的生产。

2.3.4 阴性对照品溶液的制备 按处方比例称取除黄连外其他处方药材，8倍水，浸泡1 h，回流2 h进行提取一次进行试验。煎液滤过、浓缩及定容处理方法同“2.3.3”，制备阴性对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3.5 测定法 精密吸取“2.3.2”或“2.3.3”或“2.3.4”项下制得的对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，即得。（见图1）

图1 盐酸小檗碱对照品、供试品及阴性对照品HPLC 色谱图

2.3.6 线性关系考察 分别精密量取“2.3.2”项下制备的对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分别置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置，制成质量浓度分别为2.8 μg/mL、5.6 μg/mL、8.4 μg/mL、11.2 μg/mL、14.0 μg/mL的系列对照品溶液，依照“2.3.1”项的色谱条件进行检测。依次记录峰面积，以盐酸小檗碱对照品峰面积（y）对其质量浓度（x）进行线性回归，得回归方程y=248 894x+115 651（R2=0.999 6）。结果表明，盐酸小檗碱对照品质量浓度在2.8～14.0 μg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.4 单因素考察 分别对清胃散水提工艺中原料药材粉碎与否、浸泡时间、提取时间、加水量及提取次数进行了单因素考察，根据考察结果，确定Box-Behnken响应面设计法中因素水平范围。

2.4.1 粉碎度初步考察 按照处方比例，平行称取原料药2份，分别以粉碎过12目筛和不粉碎进行试验，8倍量水浸泡1 h，回流2 h，提取1次，滤过，滤液浓缩，干燥，依法进行盐酸小檗碱含量测定。结果显示，粉碎组盐酸小檗碱含量明显高于未粉碎组，故选择原料药粉碎过12目筛。

2.4.2 浸泡时间初步考察 按照处方比例，平等称取原料药4份，粉碎，过12目筛，分别浸泡0.5、1、1.5、2 h，加8倍量水，回流提取2 h，提取次数为1次，依法测定盐酸小檗碱含量。结果显示，浸泡1.5 h后盐酸小檗碱含量增长不明显，故响应面设计法浸泡时间的水平选取1、1.5和2 h。

2.4.3 提取时间初步考察 按照处方比例，平等称取原料药4份，粉碎，过12目筛，加8倍量水，浸泡1.5 h，提取1次，分别考察回流时间为0.5、1、1.5、2 h对提取效率的影响。结果显示，提取时间在1.5 h时盐酸小檗碱含量有较大的提升，随后变化不显著，故响应面设计法提取时间的水平选取0.5、1、1.5 h。

2.4.4 加水量初步考察 按照处方比例，平等称取原料药4份，粉碎，过12目筛，分别加入6倍、8倍、10倍和12倍量水，浸泡1.5 h，回流提取2 h，提取1次，依法测定并计算综合评分，结果显示，加水量为8倍时，盐酸小檗碱含量有显著提升，随后呈缓慢上升趋势，故响应面设计法加水量的水平选取8倍、11倍和14倍。

2.4.5 提取次数初步考察 按照处方比例，平等称取原料药3份，粉碎，过12目筛，加入8倍量水，浸泡1.5 h，回流提取1 h，分别提取1次、2次、3次，依法测定盐酸小檗碱含量。结果显示，提取2次和3次的盐酸小檗碱含量差别不大，考虑到实际操作时间成本的问题，在进行响应面设计法优选时选取提取2次。

2.5 Box-Behnken响应面设计法优化提取工艺

2.5.1 实验方案设计 基于单因素试验的结果，对浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮回流时间（C）3个影响因素进行三因素三水平实验设计，评价指标为：采用Hassan公式将盐酸小檗碱和出膏率进行归一化处理，得到两个指标的几何均数OD值。公式如下：OD=（d1×d2×…dn）/n，n为指标数，di=（yi-ymin）/（ymax-ymin），yi为实际值，ymax和ymin为同一指标在实验中的的最大值和最小值[6]。因素水平表和设计结果见表1～2。

表1 试验设计因素水平表

表2 Box-Behnken 实验设计及结果

2.5.2 数据处理与结果分析 采用Hassan公式将盐酸小檗碱和出膏率2个指标进行归一化处理，得到综合评分的OD值。使用Design-Expert 8.0.6对浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮回流时间（C）进行二次多项式回归拟合，得到二次多项回归方程为：OD=0.77+0.11A+0.22B+0.20C-0.099AB-0.025AC-0.003BC-0.11A2-0.15A2-0.23C2。（见表3）

表3 方差分析及显著性实验结果

由方差分析结果可知，回归方程决定系数R2＝0.95，说明模型拟合情况较好，模型F检验P＜0.05，失拟项P＞0.05，表明该回归模型合理，可以分析和预测本水提工艺。由表3可知，回归方程中一次浸泡时间（A）、加水量（B）、提取时间（C）均对综合评分有显著影响，二次项加水量（B）和提取时间（C）对综合评分有显著影响。各因素的影响程度为B＞C＞A。

采用Design-Expert 8.0.6软件绘制浸泡时间、加水量、提取时间的综合评分的三维响应面图和等高线图，如图2～4所示。预测最佳水提工艺为：浸泡1.6 h，加水量为11.6倍，提取时间为1.1 h。

图2 浸泡时间和加水量对OD 值的等高线及响应面图

2.5.3 验证实验 根据最佳提取工艺，结合单因素试验结果，考虑到实际生产工艺操作常取整数，故调整最佳水提工艺为：原料药材粉碎过12目筛，加11倍量水，浸泡1.5 h，提取2次，回流时间为1 h。按照此工艺进行3次平行验证实验，OD值分别为0.833、0.829、0.841，平均值为0.834（RSD＝0.843%），与预测值（0.851）一致，说明该水提工艺优化后合理可行。

3 讨 论

响应面法近年来常被运用于中药有效成分的提取工艺研究[7-8]，具有实验次数少，所得结果直观，能够动态反应指标变化的优点，本试验依据清胃散传统用法，以水为溶媒，回流提取，采用响应面法设计实验，HPLC法检测其中君药黄连中盐酸小檗碱的含量，实验中尝试了乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液的不同配比，并比较了265 nm及345 nm两种检测波长[5,9]，根据色谱峰峰形及供试品杂峰的影响，最终选择乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液45∶55为流动相，检测波长为265nm。

清胃散为中药传统名方，方中黄连苦寒泻火，直折胃腑之热，为君药；升麻取其清热解毒，以治胃火牙痛，又可取其轻清升散透发，可宣达郁遏之伏火。加上牡丹皮、生地黄凉血滋阴，共同辅助黄连发挥清胃泻火之功，共为臣药；当归养血活血，以助消肿止痛，为佐药，升麻兼以引经，兼为使药。研究表明，该方中君药黄连主要含有生物碱类化学成分，其中小檗碱含量高达10%[10]，具有广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌，以及红色毛藓菌、白色念珠菌等真菌敏感[11-12]，同时还有明确的抗炎和抗氧化作用[13-15]；而复方的出膏率变化对有效成分含量以及制剂的成型等都有显著影响。故采用Hassan法对其进行归一化处理，得到几何平均OD值[6]作为评价指标，得出的最佳水提工艺为：原料药材粉碎过12目筛，加11倍量水，浸泡1.5 h，提取2次，回流时间为1 h。

图3 浸泡时间和提取时间对OD 值的等高线及响应面图

图4 加水量和提取时间对OD 值的等高线及响应面图