大同黄花菜茎段组织培养研究

韩志平， 王丽君， 张海霞， 张 琨

(1.山西大同大学生命科学学院/设施农业技术研发中心， 山西 大同 037009；2.大同黄花产业发展研究院， 山西 大同 037004； 3.山西大同大学后勤管理处， 山西 大同 037009)

黄花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)为百合科萱草属多年生草本植物，对环境条件的适应性很强，在我国南北都有栽培[1]。黄花菜是我国特有的蔬菜，其花蕾含有丰富的蛋白质、糖类、维生素、氨基酸和钙、磷、铁等矿物质[2]，还富含卵磷脂、甾类、硒等物质[3]，加上花型优美、色泽鲜艳，根系发达，具有食用、药用、绿化观赏、水土保持等多种用途[4-5]。

大同市云州区是我国第二大黄花菜主产区，位于北纬39°45′～40°13′，属最适宜作物生长的黄金纬度带范围[6-7]。由于当地光照充足、昼夜温差大，加上大同火山群下土壤肥沃疏松[8]，这里的黄花菜色泽金黄、角大肉厚、营养丰富、香味浓郁，外观品质和食用品质均为全国最优，还是大同市首个国家地理标志保护产品、全国百强农产品区域公用品牌产品[9]。目前，大同黄花菜种植规模已达1.73万hm2，仅云州区就有1.13万hm2，已经成为云州区“一区一业”的主导产业和脱贫攻坚的支柱产业。但是，目前采用的分株、切片、芽块等黄花菜种苗繁殖方法，受母株生长年限、自然生长环境和气候条件的限制很大，存在种苗成本高、纯度难以保证、繁殖系数低、周期长、繁殖时间受限、易带病虫草害等问题[10-11]，难以满足种苗批量生产的需求。植物组织培养技术具有繁殖系数高、繁殖周期短、利于保持品种的优良性状、无病虫草害等优点，已经广泛应用于蔬菜、果树、花卉、园林植物等的快速繁殖[12]。20世纪80年代起，一些学者采用黄花菜的根、根状茎、叶、花等不同部位进行了黄花菜的组织培养研究[13-16]，但至今黄花菜的组织培养技术仍不成熟，组织培养体系尚未建立，难以在生产上大规模应用。为此，本试验以大同黄花菜种子为材料，培养获得无菌苗后，以其根、茎、叶为外植体，初步研究了大同黄花菜组织培养的再生系统，为大同黄花菜组织培养体系的建立及其在生产中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在山西大同大学生命科学实验教学中心的植物学实验室进行。材料为采集自生命科学试验基地的大同黄花菜种子。供试激素包括生长素类的2,4-D和NAA、细胞分裂素类的6-BA。

1.2 试验方法

1.2.1种子灭菌和萌发预试验

为确定种子灭菌和萌发的适宜方法，设置4个处理：

1) 种子在水分充足的发芽盒中自然萌发；

2) 种子用无菌水浸泡12 h，吸干表面水分后直接接种于MS培养基上；

3) 种子用无菌水浸泡12 h，再用75%乙醇浸泡30 s，用无菌水冲洗3～4次，然后用0.1%升汞浸泡10 min，再用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸干表面水分，接种于MS培养基上；

4) 种子用无菌水浸泡12 h，用无菌滤纸吸干表面水分后剥去种皮，按处理 3) 方法灭菌后接种于MS培养基上，培养中发现发霉的种子再次灭菌后重新接种。

1.2.2无菌苗培养与外植体的获取和培养

选取饱满、整齐的种子，按预试验处理4)方法浸种、去皮、灭菌、接种。种子萌发后待幼苗第1片叶长3～5 cm时，用无菌刀片将根、茎、叶分别切为长1 cm左右的节段，接种于诱导培养基上。培养1周后将形成不定芽的材料转移到继代培养基上，每隔1周转瓶继代1次。当第1片叶长达1 cm时，转移到生根培养基上。

种子去皮、灭菌及各阶段材料的接种均在超净工作台上进行，每个阶段每瓶接种4～5个材料，每次接种后立即置于人工气候培养箱中培养，培养条件为温度(25±2)℃、光照强度2 000～2 500 lx、光照时间12 h·d-1[17]。定期用75%酒精擦拭气候箱消毒，同时观察和记录种子萌发、无菌苗生长、芽分化、叶抽生、根诱导等生长情况。

1.3 培养基和激素成分

根、茎、叶3种外植体在诱导培养阶段均设置4种基本培养基单独处理：①MS；②1/2 MS；③N 6；④1/2N 6，但同种外植体的4种基本培养基上添加的激素种类和用量均相同(表1)。继代培养阶段3种外植体均采用MS培养基，但培养基上添加的激素种类和用量各不相同。

表1 不同外植体各培养阶段所用培养基和激素成分

2 结果与分析

2.1 种子灭菌和萌发预试验

黄花菜种子坚硬，吸水和萌发困难。为使种子顺利萌发并获得能够切取根、茎、叶等外植体的健壮无菌苗，用4种方法对种子进行处理。结果发现，1) 发芽盒自然萌发的种子培养2周后大部分种子仍未萌发，少数萌发的幼苗长势较弱、叶片细长。 2) 无菌水浸泡后直接接种于MS培养基上的种子，全部被黑色霉菌污染。 3) 无菌水浸泡后再用乙醇和升汞灭菌后接种于MS培养基上的种子，也全部被黑色霉菌污染。 4) 无菌水浸泡后去皮，再用乙醇和升汞灭菌，然后接种到MS培养基上的种子，污染率降低到37.5%；污染的种子再次灭菌后接种，污染率降低到0，种子萌发率达100%。因此，后续试验采用4) 处理方法进行无菌苗的培养。

2.2 种子萌发与无菌苗的形成

种子经浸种、去皮、灭菌后接种于MS培养基上，约5 d后开始萌发，萌发率100%。再经约3 d开始形成叶片，同时根系不断伸长。培养约2周后，无菌苗第1片叶长3～5 cm、根3～5条，即可取其根、茎、叶3部分，分别切成约1 cm长的节段备用(图1)。

注：A为接种；B为萌发；C为无菌苗。

2.3 外植体诱导培养

2.3.1不同外植体切段诱导结果

无菌苗的根、茎、叶切段分别接种于诱导培养基上，茎段培养1 d后开始形成不定芽，4 d后有不定芽形成叶片；培养8 d后，多数茎段诱导产生了不定芽，并有部分抽生叶片，将形成不定芽的茎段转移到继代培养基上。根和叶的切段在诱导培养过程中没有任何形态变化，既没有产生愈伤组织，也没有形成不定芽(图2)。结果说明，茎段比根、叶的切段更容易被诱导，且不经过愈伤组织阶段，直接诱导形成不定芽。

注：A为茎段接种；B为茎段突出；C为茎段出芽并抽叶；D为叶段接种；E为根段接种。

2.3.2不同培养基上茎段的诱导培养结果

茎段在4种诱导培养基上分别培养8 d后，均诱导形成了不定芽，并有部分抽生第1片叶，没有形成愈伤组织(表2和图3)。其中MS培养基诱导率最高，1/2 MS和N 6培养基诱导率次之，1/2 N 6培养基诱导率最低；从不定芽的形态和长势看，MS和1/2 MS培养基上形成的不定芽均较壮，N 6和1/2 N 6培养基上形成的不定芽长势一般，但4种培养基上形成的不定芽均无畸形。综合比较，茎段在MS培养基上诱导形成不定芽的几率最高且长势良好，是茎段诱导培养的最适培养基，1/2 N 6培养基诱导效果最差，不宜用于茎段的诱导培养。

表2 不同培养基上茎段的诱导培养结果

注：A为MS培养基；B为1/2 MS培养基；C为N 6培养基；D为1/2 N 6培养基。

2.4 继代培养

在继代培养过程中，已经抽叶的茎段材料叶片进一步生长，其他具有不定芽的材料也陆续抽生叶片，抽叶率100%，而后开始抽生第2片叶(图4)。部分已经抽叶的材料在培养过程中被污染，培养基表面着生黄色霉菌，材料软化腐烂。经过2次继代，最终形成叶片的茎段材料存活率为86.96%。继代培养2周，当第1片叶长1 cm时，将存活的茎段材料接种于生根培养基上诱导生根。根和叶的切段在继代培养基上仍没有任何形态变化，继代培养2次后丢弃。

注：A为第一次继代；B为第二次继代；C为诱导生根；D为完整组培苗。

2.5 诱导生根

具有叶片的无根苗在生根培养基上培养约2周后开始形成乳白色的幼根，再培养2周后生根率达45%，但根系较细，长势较弱。培养过程中，茎段材料继续抽生新叶，叶片不断伸长增宽。培养约1个月形成完整的试管苗，此时多数幼苗仅发生主根，根长约1 cm，叶子2～3片，最大叶长约3 cm，少数幼苗具有3条根，第1片叶长约5 cm。

3 讨论与结论

3.1 培养过程和结果

黄花菜种子浸泡、去皮、灭菌后接种于MS培养基上，5 d后开始萌发，再经8 d形成完整的无菌苗。取无菌苗的根、茎、叶3部分，分别切为1 cm长的切段后接种于诱导培养基上；其中茎段材料8 d后产生不定芽，并抽生叶片，而后转移到继代培养基上；培养2周后，第1片叶伸长至1 cm时，转移至生根培养基上；培养约2周后开始生根，再经2周45%的茎段材料形成完整的组培苗。根和叶的切段材料在诱导培养基上没有形成愈伤组织或不定芽，继代培养也无任何形态变化。

3.2 存在的主要问题

3.2.1污染问题

种子萌发阶段出现了萌发率低、容易发霉的问题。预试验发现，种子萌发率低的原因可能是种皮坚硬，难以萌发；发霉的原因是种皮表面凹凸不平，带有杂菌，灭菌消毒不彻底。去除种皮、并对种子进行二次灭菌后种子全部萌发，也没有发生霉变。继代过程中也出现了部分材料被污染的问题，可能是接种时器具或材料灭菌不彻底造成的[18]。应特别加强材料和接种器具的灭菌消毒，并及时清理被污染的材料。

3.2.2玻璃化现象

生根培养阶段有部分材料出现了玻璃化现象，叶片呈透明或半透明状态。原因可能是：1) 继代后期到生根阶段人工气候培养箱温度和湿度过高，光照较弱[19]； 2) 培养基中无机盐离子用量、激素种类和配比不利于材料的生长和光合作用[20]。将玻璃化材料移出气候箱，在自然光照射下逐渐回绿，但1周后叶片仍然萎蔫，地上部死亡。因此，需要进一步研究黄花菜组培苗玻璃化的原因和解决方法。

3.2.3弱根系问题

试验中组培苗的生根率较低，发生的根系较细，根数也少，多数仅有主根，长势较弱。可能是因为培养基中NAA浓度不适宜材料生根[16]，也可能是继代培养后期叶片形成状况一般抑制了根的发生[21]。今后需从培养基及其添加的激素种类和浓度着手，探明根系发生少、生长弱的原因，进而解决该问题。

3.3 研究结论

本研究以大同黄花菜种子萌发形成无菌苗，再以其根、茎、叶的切段为外植体接种培养，结果只有茎段材料诱导形成了不定芽，进一步继代抽叶和诱导生根形成了完整的试管苗。说明黄花菜无菌苗的茎段可以再生为完整的组培苗，其培养途径为：去皮种子→无菌苗→茎段→不定芽→抽叶→生根→试管苗。同时发现，去皮的种子灭菌和萌发培养效果最好，MS培养基诱导不定芽的发生率最高。

试验中无菌苗的根段和叶段材料在4种培养基上单独诱导培养均没有任何形态变化，但植物细胞具有全能性，根和叶也具有培养成为完整植株的潜能[22]。今后可通过调整培养基激素种类和浓度及温、光、湿等条件，研究无菌苗的根、叶培养形成组培苗的方法和途径。此外，本研究仅对茎段诱导阶段所用培养基进行了筛选，继代和生根培养中适宜的培养基和激素配比对叶片形成、根系发生都具有重要影响，下一步需要针对该问题进行研究。

黄花菜的适应性很强，耐寒、耐旱、耐贫瘠，病虫害发生少，但生产中仍存在一些亟待改进的性状，如干旱时容易落蕾，对病毒和某些除草剂的抗性不强等[22]。利用组织培养技术可以提高花蕾品质和产量[23]。前人以黄花菜的根状茎、花器官等作为外植体进行组织培养获得成功[24-26]，但是这些材料的取材和培养效果受到生长季节、材料的发育程度和生理状况等的影响，很难用于工厂化生产。利用种子萌发形成的无菌苗进行组织培养，不受时间限制，材料充足，能够培养形成完整植株，是一种简便易行的黄花菜植株再生方法，可进一步研究并建立其组织培养体系，为黄花菜的快速繁殖和工厂化育苗奠定基础。