高粱种质种子萌发期耐冷性鉴定与综合评价

张国琴， 葛玉彬， 张正英

(甘肃省农业科学院作物研究所， 兰州 730070)

高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)是粮食、饲料、纤维和生物能源等的重要原材料[1-2]。春播后遇低温冷害，导致萌发率、出苗率降低，出苗后植株长势较弱且生长缓慢，从而减少作物产量[3-4]；高粱耐冷性较差限制高粱早期生长，降低生物量和产量，从而限制了高粱在全球更多地区的推广利用[5-8]。因此，为确保高粱能在更多温带地区尤其是在西北高寒地区推广利用，对高粱早期耐冷性分子研究和耐冷新品种选育至关重要。而对高粱种质耐冷性的筛选鉴定是开展耐冷性研究的基础。利用种子萌发期预测作物耐冷性是一种便捷可靠的方法[9]，目前筛选出高粱种质耐冷性评价的形态指标和生理指标有：萌发势、萌发率、发芽率、出苗率、幼苗成活率、幼苗萎蔫程度以及电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性等[10-17]，但大多数都采用单一指标作为测定指标，而单一指标很难真实反映植物的耐冷性实质[9]。国内外学者均有对高粱种质耐冷性鉴定筛选的研究，由于高粱起源于热带地区，在我国主要分布于温带地区。国内学者根据本地实际情况设置低温胁迫温度，对收集到的国内外高粱种质进行耐冷性鉴定，筛选出的耐冷性种质大多数来源于我国，但其耐冷性评价方法和筛选分类方法单一[10-16]；国外研究中设置的胁迫温度较高，筛选出的耐冷种质有PI 195754、PI 563849、PI 567939等，其中大部分也来源于我国[18-19]。目前在高粱种子萌发期耐冷性鉴定试验中存在测定指标、耐冷性评价方法及筛选分类方法单一等问题。因此，本研究参照国内高粱种质耐冷性鉴定方法，以5个性状指标对来自国内外的60个高粱种质种子萌发期耐冷性进行鉴定试验，采用3种综合评价方法对参试种质进行筛选分类，为高粱种质种子萌发期耐冷性鉴定与评价及耐冷性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取60份来自国内外的高粱种质为试验材料，其中有地方品种、保持系、恢复系、自交系及杂交种。名称及来源详见表3。

1.2 试验方法

每份高粱种质选取正常成熟、籽粒饱满且大小均匀的种子1 000粒，首先用70%的酒精进行表面消毒1 min，再用15%的次氯酸钠浸泡10 min，期间不停摇晃，然后用无菌水清洗3次，各种质挑取大小均匀的种子100粒摆放于直径9 cm、铺2层有足够无菌水滤纸的培养皿中，每盘为1次重复，参照陈香兰等[11]、张桂香等[12]和张丽霞等[14]高粱萌发期耐冷性鉴定方法，于4 ℃的智能培养箱中黑暗处理7 d，然后调试温度到25 ℃，培养3～5 d，以室温(25 ℃)条件下的处理设为对照(ck)，处理组和对照组分别设置3次重复，观察发芽情况，以萌发的幼芽达到种子长度的1/2为发芽标准，并在调查发芽率后每个处理各重复随机取10粒发芽种子测定相关指标。

1.3 指标测定

1.3.1发芽率的统计

供试材料置于低温(4 ℃)人工智能培养箱中黑暗处理7 d，然后调试温度到室温(25 ℃)，3～5 d后统计种子的发芽率。对照材料置于室温(25 ℃)人工智能培养箱中，5～6 d后统计种子的发芽率。

1.3.2生物学指标测定

调查发芽率后每个处理各重复随机取20粒发芽种子测定胚芽长度(GL)、胚根长度(RL)，立即用万分之一天平称各重复的胚芽鲜重(FGW)和胚根鲜重(FRW)。

1.4 耐冷性评价统计方法

采用Microsoft Excel 2007软件整理数据，用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。采用耐冷系数(cold tolerance coefficient，CTC)、综合耐冷系数(comprehensive cold tolerance coefficient，CCTC)、加权耐冷系数(weighted cold tolerance coefficient，WCTC)以及基于隶属函数值μ(Xi)的加权隶属函数值(weighted subordinate function value，WSFV)的综合评价方法对供试材料耐冷性进行评价。计算公式如下：

CTC=低温条件的测量值/常温条件的测量值

(1)

(2)

(3)

(4)

μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，i=1，2，3……，n

(5)

(6)

2 结果与分析

2.1 不同处理间高粱种子萌发期主要性状差异分析

由表1可见，与对照相比，低温胁迫处理后的各项指标均有所下降，下降程度依次为胚根长(80.99%)>胚芽长(42.50%)>发芽率(28.90%)>胚芽鲜重(2.25%)>胚根鲜重(2.29%)。低温处理条件下，各指标变异系数范围为32.35%～61.59%，常温处理条件下，各指标变异系数范围为9.24%～41.35%。表明所有性状均受到了低温胁迫的抑制，且不同指标在2种处理条件下的变化幅度存在差异，达到极显著水平。两处理间各性状差异均达到了极显著水平，说明参试种质胁迫处理下效果明显，不同种质间耐冷性存在显著差异。

2.2 高粱种子萌发期测定性状耐冷系数分析

根据低温处理和常温条件(ck)下各性状指标的测定值，通过公式(1)计算出各种质各测定性状的耐冷系数(表2)。各性状的耐冷系数(CTC)值存在明显差异，变异幅度较大，变异系数介于33.51%～61.55%之间(表2)，同一指标不同供试材料耐冷系数变化明显，说明各指标对低温胁迫反应的敏感性不同。

表2 供试种质各性状耐冷系数参数

2.3 低温胁迫下高粱种子萌发期耐冷性综合评价

由表3可知，加权隶属函数、加权耐冷系数、综合耐冷系数变幅较大，变异系数分别为38.18%、22.79%、21.48%，说明各材料种子萌发期对低温的敏感性不同；表4为3种综合评价方法相对耐冷级别的划分，根据公式(5)和(6)计算加权隶属函数值，通过系统聚类法将参试种质分为5个相对耐冷级别，其中一级耐冷种质有6份，占参试品种的10%；二级耐冷种质有19份，占参试品种的31.66%；三级耐冷种质有10份，占参试品种的16.66%；四级耐冷种质有16份，占参试品种的26.66%，五级耐冷种质有9份，占参试品种的15%。一级耐冷种质分别是平凉1 B、日本高粱、SX 482141、平恢4号、晋草10号、SX 48214247，五级耐冷种质分别是泰斯、辽甜6号、NTJ-2(IS 33892)、新高粱9号选、89105(R)、扫帚高粱、J101-R、凯勒、陇南403。

表3 供试种质的名称、来源及耐冷性综合评价

表4 供试高粱种质种子萌发期相对耐冷级别划分

根据公式(2)计算综合耐冷系数，通过系统聚类法将参试种质分为5个相对耐冷级别。其中一级耐冷种质有7份，占参试品种的11.66%；二级耐冷种质有17份，占参试品种的28.33%；三级耐冷种质有14份，占参试品种23.33%；四级耐冷种质有17份，占参试品种的28.33%；五级耐冷种质有5份，占参试品种的8.33%。一级耐冷种质分别为平凉1 B、SX 482141、SX 482142、IS 21893、ICSV 25265(IS 2331-1-1)、晋草10号、IS 38947，五级耐冷种质分别是89105(R)、泰斯、J101-R、扫帚高粱、NTJ-2(IS 33892)。

根据公式(3)计算加权耐冷系数，通过系统聚类法将参试种质分为5个相对耐冷级别。其中一级耐冷种质有3份，占参试品种的5.0%;二级耐冷种质有13份，占参试品种的21.66%；三级耐冷种质有11份，占参试品种的18.33%；四级耐冷种质有19份，占参试品种的31.66%；五级耐冷种质有14份，占参试品种的23.33%。一级耐冷种质分别为平凉1 B、晋草10号、日本高粱，五级耐冷种质分别是NTJ-2(IS 33892)、辽甜6号、IS 39439、IS 11861、89105(R)、1-M-3、扫帚高粱、2-M-2、2-M-2、熊岳191-2、凯勒、2-W-2、泰斯、J 101-R。

表3(续)(Continued table 3)

2.4 3种评价方法综合评价高粱萌发期耐冷性

根据3种综合评价方法，以分类结果出现重复为依据进行评价。一级耐冷种质16份，分别为平凉1 B、日本高粱、SX 482141、平恢4号、晋草10号、SX 482142、平凉1 B、SX 482141、SX 482142、IS 21893、ICSV 25265(IS 2331-1-1)、晋草10号、IS 389475、平凉1B、晋草10号、日本高粱，其中3种评价方法都检测到的材料为平凉1 B、晋草10号，这2份材料可能为高粱种质种子萌发期耐冷性较强材料。五级耐冷种质27份，分别为泰斯、辽甜6号、NTJ-2(IS 33892)、新高粱9号选、89105(R)、扫帚高粱、J 101-R、凯勒、陇南403、89105(R)、泰斯、J 101-R、扫帚高粱、NTJ-2(IS 33892)、NTJ-2(IS 33892)、辽甜6号、IS 39439、IS 11861、89105(R)、1-M-3、扫帚高粱、2-M-2、2-M-2、熊岳191-2、凯勒、2-W-2、泰斯、J 101-R。其中3种评价方法都检测到的是泰斯、89105(R)、扫帚高粱、NTJ-2(IS 33892)、J 101-R。

3 讨论与结论

3.1 高粱种质种子萌发期耐冷性鉴定的测定指标与综合评价方法

国内外学者对高粱耐冷性进行了鉴定筛选研究，选出高粱种质耐冷性评价形态指标和生理指标，如萌发势、萌发率、发芽率、出苗率、幼苗成活率、幼苗萎蔫程度以及电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性等[10-17]。本研究选择的5个测定指标中同样使用了以直接评价为指标的发芽率，同时还增加了胚芽长、胚根长、胚芽鲜重和胚根鲜重等幼芽性状指标，这些性状指标是在国内高粱种子萌发期耐冷性研究中没有关注的指标，可以提高鉴定结果的可靠性。

植物的耐冷性是受多因素影响的复杂性状，单一指标很难真实反映植物的耐冷性实质[9,20]，本研究中同一高粱种质在不同指标性状下的耐冷系数存在差异，用任何单一指标的耐冷系数来评价所得的结果均不尽相同。而综合耐冷系数能反映品种的耐冷性，但不能反映某一指标在所有测试指标中的比重，加权耐冷系数综合各指标比重；耐冷性隶属函数值是用几个指标综合评定作物的耐寒性使单个指标的局限性得以弥补，消除了不同基因型种质间固有的生物学和遗传学特性差异，从而使其评定结果与实际更为接近，加权隶属函数值采用隶属函数和耐冷指标权重相结合的方法对耐冷性进行综合评价[9,21-23]。本研究选取了与高粱种子萌发期相关的5个耐冷指标，通过计算各指标耐冷系数和隶属函数值，采用综合耐冷系数，加权耐冷系数和加权隶属函数值对高粱种子萌发期耐冷性进行评价，使结果更加准确。

在高粱种质耐冷性评价分级标准方面，前人多采用单一指标的耐冷系数(萌发率、发芽率或者出苗率)的大小对材料评价分级[10-16]。本研究依据3种方法进行了综合分析，通过聚类分析将高粱种质种子萌发期耐冷性分为5个相对耐冷等级，且3种方法鉴定出相对强耐冷型种质与相对敏感型种质同级率较高，结果更为准确。

3.2 高粱耐冷种质的筛选

不同作物品种在低温下的发芽能力有显著差异，基因型在很大程度上决定着种子发芽过程中的耐冷性[9]，不同类型的高粱种质不同时期对低温的敏感程度不同，国外在对高粱种质资源耐冷性鉴定研究中发现，中国地方品种耐冷性较强，在实验室低温胁迫下表现出更高种子萌发率，在田间条件下出现更高的出苗率和更好的幼苗活力，并通过基因渗入的方法将耐冷性状转育到其他优良自交系中，从而选育和扩大优良耐冷性高粱种质资源[6,24-25]。陈香兰等[11]对来自黑龙江省各地的1 380份材料进行了芽期和苗期耐冷性筛选鉴定，初步选出芽期耐冷材料217份，苗期耐冷材料96份，芽期和苗期都耐冷的材料9份。张海燕等[15]对国内外167份(包括我国地方品种、育成种和国外引进高粱)种质资源进行了种子萌发期耐冷性鉴定，筛选出耐冷种质12份，其中包括4份我国地方品种、2份我国育成品种和6份国外品种。张丽霞等[14]对引进和收集国内外的631份高粱种质，通过逐步低温处理的方法筛选出7份耐低温材料，其中包括2份我国地方品种、2份我国常规种和3份国外品种，说明我国的种质资源中含有丰富的耐冷材料。

本研究参试60份高粱种质中包括中国地方品种、育成品种、自交系和国外引进种质，研究结果发现，我国大多数地方品种、育成品种和自交系在低温处理7 d后恢复常温，种子发芽率相对于国外引进的高粱种质更高，这与国外高粱种质室内耐冷性研究结果一致[18-19]。用5个性状指标3种综合评价方法都检测到的强耐冷型种质平凉1 B和晋草10号，都是由我国自主选育的保持系和杂交种，但仍需进一步在大田早播条件下进行验证并在育种实践中加以利用。另外，用加权隶属函数值和综合耐冷系数两种方法都鉴定出的强耐冷型高粱种质SX 482141、SX 482142，也需进一步在大田早播条件下进行验证并加以利用，此外也可以利用鉴定出的极端材料进行构建耐冷遗传群体，进一步对高粱的耐冷机制进行分析。