基于表型性状和SSR标记的9份万寿菊种质遗传多样性分析

宋江琴， 唐 楠， 唐道城， 丁圆圆， 马洪强

(青海大学高原花卉研究中心/青海省园林植物与观赏园艺重点实验室， 西宁 810016)

万寿菊(TageteserectaL.)为菊科万寿菊属的一年生植物，原产于墨西哥，因花期长、花型丰富、花色艳丽、易于栽培以及抗病虫害能力较强等优点，在园林景观布置和色素提取上应用广泛[1]；另外，因其净化空气和美化环境的功能，市场上对万寿菊的需求也逐渐增大。万寿菊生产上多采用两系配套法制种，即强优势恢复系与雄性不育两用系中的不育系进行杂交获得F1代种子[2-3]。因此，筛选出具有育种潜力的万寿菊雄性不育两用系，对利用雄性不育两用系进行种质创新具有重要意义。

目前国内对万寿菊种质资源的遗传多样性研究报道较少，宋江琴等[4]利用SSR分子标记分析了24份万寿菊雄性不育材料的遗传多样性，结果表明，供试材料具有一定的多样性，并发现部分标记与育性和株高有一定的联系。杨洁等[5]利用SSR分子标记建立了部分万寿菊品种(系)的指纹图谱。杨帆[6]对万寿菊SSR-PCR体系进行了优化。利用形态学标记对万寿菊进行遗传多样性评价较少，其中伍亚平[7]从形态学标记、生化标记、分子标记三个方面对9个万寿菊两用系进行遗传差异性分析，研究其遗传关系。

本研究结合形态学标记和SSR分子标记从万寿菊表型和基因型两方面分析材料的遗传关系，计算材料之间的变异系数和多样性指数，进行性状间主成分分析和材料间聚类分析，并构建了供试材料的数字指纹图谱，为万寿菊亲本选育、种质资源鉴定等相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以青海大学高原花卉中心选育的9个万寿菊雄性不育两用系(C×40-1(2)、34-2(2)、5-2、C×40-1(1)、35-1、34-1、C×40-1(3)、2-2、34-2(1))可育株为材料(表1)。

1.2 9个万寿菊表型性状的测量

根据《中华人民共和国万寿菊DUS测试指南》中品种性状记载标准，对8个数量性状(株高、冠幅、花朵数、一级分枝数、花径、开花前期、单花花期、千粒重、花色)采用测量法统计，对1个质量性状(花色)采用目测法记录(表1)，将花色分成三个色号，即1#(偏浅黄色)，2#(偏橙色)，3#(偏橘红色)。每个品系至少测量30株。

1.3 SSR分子标记

于2018年7月从试验田采集材料盛花期嫩叶为样本，每株取3～5片叶，液氮冷冻，-80 ℃保存。采用改良CTAB法[8]进行DNA提取，用琼脂糖凝胶电泳(2%)和微量核酸仪检测DNA质量和浓度，DNA提取液于-20 ℃保存备用。SSR引物序列来源于青海大学高原花卉中心万寿菊2-2转录组信息(表2)[4]。从78对合成的引物中筛选出11对多态性良好的引物进行扩增分析，琼脂糖凝胶电泳(2%)检测是否具有目标条带，利用8%聚丙烯凝胶电泳电压220 V分离约1.2 h，使用硝酸银染色法进行染色，显影后记录基因型数据。

1.4 统计分析

计算表型性状的均值、标准差、变异系数和 Shannon-Weaver 多样性指数。Shannon-Weaver多样性指数的计算参考孙东雷等[9]的方法。利用SPSS 19.0软件进行性状间的主成分分析和显著性分析[10]，材料间的聚类分析，采用Ward 法和欧氏距离进行系统聚类。

统计目标位置条带的有无，赋以“1”或“0”，缺失数据记为“-9”，建立“0，1”分子数据矩阵。通过Cervus 3.0软件[11]计算引物的PIC(多态性信息)值。利用Popgen(Version 1.32)软件[12]计算各引物的观察等位基因数(Na)，有效等位基因数(Ne)，Nei’s多样性指数和Shannon’s信息指数(I)等遗传参数；利用 NTSYS(version 2.10 t)软件计算9个两用系品系间的遗传相似系数并进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析。

2 结果与分析

2.1 形态指标的观测与分析

对9个万寿菊雄性不育两用系的9个表型性状进行记录与分析(表1)。结果表明，9个两用系株高范围66.31～77.8 cm，变异系数7.2%；冠幅范围42.63～69.53 cm，变异系数12.6%；花朵数范围17.33～36.8朵，变异系数最大(19.7%)；一级分支数范围12.27～15.63，变异系数10%；花径范围6.33～7.71 cm，变异系数2.9%；开花前期范围61～66 d，变异系数最小(2.8%)；单花花期范围24～27 d，变异系数3.7%；千粒重范围3.15～4.53 g，变异系数16.8%。结合变异系数，Shannon-Wiener信息指数和方差分析结果可以看出，除单花花期外，株高、冠幅、花朵数、一级分支数、花径、千粒重和开花前期在品系间差异均达到极显著水平(p<0.01)。一级分枝数的遗传多样性指数最大，表明在9个两用系中一级分枝数性状变异丰富。其次是千粒重、冠幅、开花前期、花径、株高、花朵数。单花花期的遗传多样性指数最小，表明9个两用系的单花花期时间较为一致。

表1 9个万寿菊雄性不育两用系性状统计分析

2.2 基于形态指标对不同品系的主成分分析

以8个数量性状为基础，一般特征值大于 1 作为提取成分的标准[19]，提取的3个主成分的特征值均大于1(表2)，可以反映原始变量的主要信息。3个主成分的方差贡献率分别为42.588%，23.028%，17.731%，累计贡献率达到83.348%。以选取主成分荷载值绝对值大于0.5的性状为标准[14-15]，第一主成分主要包括株高、冠幅、花朵数、一级分枝数、花径等性状，主要反映植株的长势、花朵等信息。第二主成分主要包括千 粒重等性状，主要反映了植株种子的情况。第三主成分主要包括花径、单花花期等性状，主要反映单花开放时间及植株营养生长时间等信息。株高、冠幅、一级分枝数、花朵数基本上可以作为反映这9个万寿菊两用系的表型性状，简化了描述指标，可视为今后这9个万寿菊两用系种质资源评价和亲本选择的主要考量指标。

表2 不同品系形态指标的主成分分析

2.3 基于形态指标对不同品系的聚类分析

以8个数量性状为基础，对9个万寿菊雄性不育两用系进行聚类(图1)，结果表明，在阈值为5时，9个两用系被聚成三个大组，第一大组又包括2个小组，其中第一小组包括34-2(2)，5-2和34-2(1)，花朵数量集中在35～37朵之间，株高均在77 cm左右；第二小组包括C×40-1(2)，C×40-1(1)和C×40-1(3)，为同一系列不同花色的3个品系；第二大组包括35-1和34-1，花色均为浅黄色。材料2-2被单独聚成一类，其冠幅和花朵数均极显著低于其他品系，表明2-2与其他组的材料之间有较大的形态差异。

图1 基于8个数量性状的聚类分析

2.4 基于SSR标记的引物多态性分析

用筛选出的11对多态性良好，条带清晰，易于读带的SSR引物在9个两用系中的扩增信息如表3，对9个两用系品系的扩增结果如图2。11对引物共检测到29个条带，其中27个具有多态性，多态性比率为93.1%，平均每个位点等位基因数为2.45个。观测等位基因数(Na)为2；有效等位基因数(Ne)为1.78；Nei’s多样性指数(H)为0.429 1；Shannon信息指数(I)为0.607 8。本研究筛选的11对SSR引物的PIC值为0.353，具有中度多态性，说明11对引物可用于9个两用系材料的遗传多样性分析[16]。

注：材料编号1～9分别代表的材料名称为C×40-1(2)、34-2(2)、5-2、C×40-1(1)、35-1、34-1(2)、C×40-1(3)、2-2、34-2(1)。A→K：分别代表引物U 0860，U 1829，U 1456，U 0878，U 1795，U 1757，U 2041，U 2261，U 106-1，U 203，U 358对9个材料的PCR扩增结果。

2.5 基于SSR标记的9个万寿菊雄性不育两用系遗传多样性分析

遗传距离(表4)表明，材料34-2(2)和35-1材料的遗传距离最大(0.968 3)，表明其亲缘关系最远；C×40-1(2)和2-2的遗传距离最小，为0.072，表明这两者亲缘关系最近。基于SSR标记的聚类结果(图3)，当阈值为0.60时，9个雄性不育两用系被分成三大组，第一大组包括C×40-1(2)，5-2，C×40-1(3)，2-2和34-2(2)；第二大组包括C×40-1(1)；第三大组包括35-1，34-1和34-2(1)。综合形态聚类结果可以发现，最终35-1，34-1在表型聚类和分子聚类的同一类中，被聚为一类；C×40-1(3)，C×40-1(2)，5-2和34-2(2)在表型聚类和分子聚类的同一类中，被聚成一类；34-2(1)，2-2 和C×40-1(1)在表型和分子的聚类结果不一致。

表4 9个万寿菊雄性不育两用系遗传距离

图3 9份万寿菊种质资源基于SSR标记的UPGMA聚类

2.6 指纹图谱构建

利用筛选出的11对SSR引物对9个万寿菊品系进行数字指纹图谱的构建(表5)。由SSR-PCR扩增图谱发现，引物U 1757、U 2041和U 1829可以将供试的9个万寿菊品系全部区分开来。对筛选出来的3个引物的扩增结果条带分别进行“0”“1”读带，构建3个万寿菊的数字指纹图谱。使用2对引物U 1757和U 2041可以区分7个(78%)品系，再结合引物U 1829可以完全区分9个品系。

表5 9个万寿菊雄性不育两用系品系数字指纹图谱

3 结论与讨论

万寿菊种质资源创新通常是通过从国外引进新品种来实现，选育一些适合本土生长的万寿菊新品种具有市场性和创新性，故了解现有万寿菊种质资源的遗传背景及差异性有其必要性。本研究对9个万寿菊雄性不育两用系的9个形态学标记和11个SSR分子标记的多样性分析结果表明，供试材料具有丰富的遗传多样性。万寿菊的选育通常是根据形态的综合指标来进行，然而表型性状易受环境因子的影响，不能准确地对万寿菊品系进行鉴定。SSR分子标记具有较高的灵敏度，在一定程度能从DNA水平上揭示材料的遗传变异，故通过形态学差异结合分子标记技术来分析材料的遗传多样性，增加了结果的可靠性与科学性。

供试材料的表型遗传多样性指数为1.49，略低于多头菊种质资源的数量性状的遗传多样性指数(1.856)，数量性状中花朵数的变异系数最大，为19.7%，但明显低于多头菊的花朵数[17]，说明供试万寿菊的花朵数较多头菊来说该性状较为稳定。各性状除单花花期外，在品系间的差异均达到了极显著水平，说明这9个万寿菊种质资源之间的差异较大，作为母本选育的潜能也较高。主成分分析可以筛选出具有代表意义的性状，从8个表型性状中提取了3个主成分因子，累计贡献率达到83.348%，微低于非洲菊的7个主成分累计贡献率86.567%[21]。3个主成分因子中，荷载值较大的性状代表了主要的表型性状变异，其中影响这9个万寿菊种质资源表型差异较大的性状主要有株高、冠幅、一级分枝数和花朵数。

本研究利用11对SSR引物扩增出29个条带，其中27个条带具有多态性，远高于张华丽等[18]筛选出来的引物多态性比率(43.3%)。从引物扩增条带数来看，李浦[19]筛选出来单对引物扩增条带数(2.1)与本研究(2.45)基本一致。材料34-2(2)和35-1的遗传距离最大，亲缘关系最远；C×40-1(2)和2-2的遗传距离最小，亲缘关系最近。分子标记遗传多样性结果表明，9个两用系的Shannon信息指数为0.607 8，遗传相似系数的变化范围为0.54～0.82，平均值为0.679，说明这9个万寿菊雄性不育两用系具有较为丰富的遗传多样性，这一结果和表型遗传多样性分析结果基本一致[22]。虽然表型聚类和分子聚类结果没有达到完全吻合，但材料34-1和35-1；C×40-1(3)、C×40-1(2)、5-2和34-2(2)无论是在表型层面还是分子层面均划为一类。部分材料聚类结果没有达到一致，其原因可能与表型性状易受环境影响，测量时有一定的误差有关；也有可能与SSR位点的数目太少，不足以覆盖万寿菊整个基因组，以及供试样本的数量有关，这些因素都会影响两种聚类方法的结果，但两种聚类结果都有一定程度的参考作用[20]，为万寿菊亲本的选育奠定一定的理论基础。

本研究利用3个SSR引物将9个万寿菊雄性不育两用系完全分开，构建了数字指纹图谱，为不同万寿菊品系的区分、杂交亲本的选择提供了依据。