基于生物信息学的银屑病基因集富集及免疫细胞浸润分析

周 扬，韩 露，方如男，赵 艳，郭 杨，翟 烨，李 萍，李建红

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；3.北京中医医院，北京 100010）

银屑病（Psoriasis）是一种遗传与环境共同作用的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，发病机制目前尚不完全清楚［1］。银屑病易于复发、影响美观、可伴发代谢综合征等系统性疾病，严重影响了患者的生活质量。对银屑病有效治疗靶点的探索一直是皮肤科领域研究的热点和重点。

近年来，生物信息学越来越多的应用于包括银屑病在内的自身免疫相关的疾病的发病机制研究。有研究者对筛选出的银屑病差异基因进行了基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes，KEGG）富集研究，然而这种方法可能会遗漏某些差异不显著但功能重要的基因［2］。目前对于免疫细胞的研究也局限于T 淋巴细胞、肥大细胞等几个种类，尚需全面系统的揭示参与银屑病发病的多种免疫细胞的浸润和作用机制。

本研究应用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）进行全基因组表达分析，根据基因表达与类别之间的相关性对基因进行排名，筛选出在银屑病中上调的基因集和通路［3］。同时，利用CIBERSOFT 反卷积算法进行22 种免疫细胞浸润分析，分析银屑病中各类免疫细胞之间的相互作用，以期更深入的研究银屑病的发病机制，为临床治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 基因芯片数据

从基因表达数据库（Gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载编号为GSE6710，平 台 为GPL96［（HG-U133A）Affymetrix Human Genome U133A Array］的芯片数据集和注释文件。该研究包含26 个样品，来自于13 位寻常型银屑病患者的皮损和非皮损活检样本。

1.2 GSEA 分析

从GSEA 官网（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下 载GSEA（GSEA_4.0.3）软 件 及c5.all.v7.0.symbol.gmt 和c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 文件，使用GSEA 软件对芯片数据矩阵分别进行1 000 次模拟分析，获取GO 和KEGG 富集分析结果。

1.3 免疫细胞浸润矩阵

对来自GEO 数据的芯片数据进行分组，使用R软件“Bioconductor-limma”包进行数据矫正。从CIBERSOFT 官 网（https：//cibersort. stanford.edu/）下载22 种免疫细胞基因表达矩阵及R 包，使用R 软 件（https：//www. r-project. org/ R_3.6.3）“e1071”包获取免疫细胞浸润矩阵。运用Perl 脚本，筛选P＜0.05 的可信样本，获得新的过滤后的免疫细胞浸润矩阵。

1.4 样本聚类评价

使用R 软件进行主成分分析，对过滤后的免疫细胞浸润矩阵数据进行降维处理，并通过R 软件“ggplot2”包获取主成分分析图像。

1.5 免疫细胞浸润评估

使用R 软件绘制柱状图、热图、共表达热图、小提琴图、成对差异图，用以分析免疫细胞浸润分布差异及其相关性。

2 结果

2.1 GSEA 分析

在GO 富集分析中，共2 616 个基因集在银屑病皮损中上调，其中526 个基因集FDR＜25%，558 个基因集P值＜0.05，见图1A。主要富集于核分裂的调 节（regulation of unclear division）、染 色 体 分 离（chromosome segregation）等细胞增殖相关过程和细胞质模式识别受体信号通路（cytoplasmic pattern recognition receptor signaling pathway）、天然免疫反应的激活（activation of innate immune response）等免疫相关过程。表1 展示了在银屑病皮损中上调的归一化富集分数（Normalized Enrichment Score，NES）排名前20 的基因集。

表1 GO 富集分析NES 前20 的基因集Tab 1 GO enrichment analysis of the top 20 gene sets of NES

在KEGG 富集中，共95 条通路在银屑病皮损中上调，其中20 条通路FDR＜25%，21 条通路P值＜0.05，见图1B。主要富集于细胞周期（cell cycle）、亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）、嘧啶代谢（Pyrimidine metabolism）等细胞增殖相关过程和Nod 样受体信号通路（Nod like receptor signaling pathway）、RIG-Ⅰ样受体信号通路（RIG-Ⅰlike receptor signaling pathway）、Toll 样受体信号通路（Toll like receptor signaling pathway）等免疫相关过程以及P53 信 号 通 路（P53 signaling pathway）、膀 胱 癌（Bladder cancer）等癌症相关通路。表2 展示了在银屑病皮损中上调的NES 排名前20 的通路。

表2 KEGG 富集分析NES 前20 的基因集Tab 2 KEGG enrichment analysis of the top 20 gene sets of NES

图1 银屑病基因表达矩阵的GSEAFig 1 GSEA of gene expression matrix of scurf disease

2.2 免疫细胞浸润分析

经Perl 脚本P＜0.05 的筛选后，获得包含26 个可信样本的免疫细胞浸润矩阵。对22 种免疫细胞的浸润矩阵的主成分分析显示银屑病皮损样本和非皮损样本组间差异明显，样本来源可靠，能够区分银屑病皮损组和非皮损组，见图2。

图2 二维PCA 聚类图Fig 2 Two dimensional PCA clustering diagram

2.3 免疫细胞浸润分布及组间差异分析

图3A、B 的热图、柱状图显示了22 种免疫细胞在不同样本中浸润分布差异，前13 组为银屑病非皮损组样本，后13 组为银屑病皮损组样本。图3C 为22 种免疫细胞的组间浸润差异小提琴图，蓝色为非皮损组，红色为银屑病皮损组。如图3C 所示22 种免疫细胞中组间浸润显著（P＜0.05）的有5 种。其中活化的记忆T 细胞（T cells CD4 memory activated，TM）、滤泡辅助性T 细胞（T cells follicular helper，Tfh）、M0 巨噬细胞、活化的树突状细胞在银屑病皮损组中上调，未活化的肥大细胞在银屑病皮损组中下调。图3D 为以上5 种组间浸润差异显著的免疫细胞在来源于同一个体的样本中的成对差异分析图。

图3 银屑病皮损组与非皮损组免疫细胞浸润差异Fig 3 The difference of immune cell infiltration between lesional and non lesional psoriasis

2.4 免疫细胞相关性分析

活化的树突状细胞与Tfh 呈正相关（r=0.59），活化的肥大细胞与M0 巨噬细胞呈正相关（r=0.67）。未活化的肥大细胞和活化的记忆T 细胞TM 呈负相关（r=-0.64），M1 巨噬细胞与调节性T细 胞（T cells regulatory，Treg）呈 负 相 关（r= -0.63），M0 巨噬细胞和未活化的肥大细胞呈负相关（r=-0.58）。见图4。

图4 免疫细胞相关性分析Fig 4 Correlation analysis of immune cells

3 讨论

在GO 富集分析中，核分裂、染色体分离等与细胞有丝分裂功能相关的基因集在银屑病皮损中显著上调，细胞增殖活跃。在KEGG 富集分析中，涉及DNA 复制、核苷酸代谢、蛋白质代谢、脂质代谢的信号通路在银屑病皮损中显著上调，为细胞增殖提供了能量供应和物质储备。角质细胞的过度增殖是银屑病的基本病理特征之一。在现有的发病机制的模型中，角质细胞在疾病触发早期和疾病慢性期方面起着至关重要的作用，当皮肤环境改变时，受损的角质细胞释放的抗菌肽与自身遗传物质结合形成复合物，进而激活树突状细胞开启适应性免疫，放大了局部免疫反应，在这种炎症环境中，IL17、TNF-α、IFN-γ 等细胞因子又激活了角质细胞的增殖［4］。角质细胞的增殖在银屑病中的意义并不仅限于此，有研究发现，银屑病角质细胞中47.3%的上调基因与细胞因子的诱导信号无重叠，这表明银屑病表皮可能存在不依赖于炎性细胞因子环境的内在变化［5］。因此，抑制角质细胞的过度增殖，减少细胞增殖所必需的能量供应和物质储备，或许可以成为银屑病治疗的一种新思路。Zhang 等［6］通过删除小鼠模型中角质细胞中的葡萄糖转运蛋白1，显著抑制了小鼠模型的皮肤增厚和炎症反应。这种通过抑制细胞代谢从而抑制细胞增殖的方法在肿瘤的研究中应用颇多，主要集中于PI3K-AKT 信号通路。银屑病与肿瘤存在着细胞过度增殖的相似性，且抑制细胞的能量供应亦能有效减轻银屑病皮肤增殖和炎症反应，对于银屑病角质细胞增殖与细胞代谢的研究，应该进行更加深入的研究。

Nod 样受体、RIG-Ⅰ样受体、Toll 样受体均为模式识别受体，在先天免疫中起着识别病原体和内源性细胞应激信号的作用，从而激活NF-κB、MAPK等信号通路，促进炎症细胞因子的转录，进而介导免疫反应［7，8］。因此这些模式识别受体信号通路的的负调控对于银屑病的治疗具有重要意义。众所周知，P53 是一种抑癌基因，具有诱导细胞凋亡的作用，本研究显示，P53 在银屑病皮损组上调，结果与大多数研究相一致［9-11］。P53 在银屑病皮肤中的表达可能是角质形成细胞过度增殖所诱导的野生型蛋白，是一种对抗过度增殖的保护机制，只不过这种保护机制可能不足以减弱过度增殖状态［12］。除诱导凋亡外，P53 也具有抗凋亡的功能，P53 可以靶向促生存的Bcl-2基因的miR-34，因此P53 信号不应被视为单纯的诱导凋亡［13］。

本研究得到的Tfh、Th 和活化的树突状细胞在银屑病皮损中上调，活化的树突状细胞与Th 呈正相关的结果与现有银屑病发病模型基本符合，即抗原激活树突状细胞后，树突状细胞对其进行处理提呈，激活Th，分泌炎性细胞因子维持炎症环境，而这种炎症环境又促进了TM 的增殖［14，15］。然而关于巨噬细胞和肥大细胞，仍需进一步讨论。在本研究中，M0 巨噬细胞在银屑病皮损组上调，M1 巨噬细胞与Treg 呈负相关。巨噬细胞分为M0、M1、M2 三种表型，M0 巨噬细胞为未经激活的幼稚的巨噬细胞，M0 巨噬细胞收到M1 或M2 特异性信号则会被激活为M1 巨噬细胞或M2 巨噬细胞［16］。一般来说，M1 巨噬细胞的作用是介导炎症和细胞/组织损伤，M2 巨噬细胞则调节银屑病的抗炎和修复［17］。

本研究结果显示，未活化的肥大细胞在银屑病皮损组下调，而活化的肥大细胞却未在皮损组上调。肥大细胞在许多皮肤病中是瘙痒的介导物，有研究表明，P 物质在银屑病斑块中表达增加，而P 物质在精神紧张的情况下可以导致肥大细胞脱颗粒，进而出现瘙痒［18，19］。正常皮肤中不会出现皮肤瘙痒，因而肥大细胞的活化程度较低，而在银屑病皮损中，有部分患者会出现皮肤瘙痒，但并不具有普遍性，这可能是未活化的肥大细胞在银屑病皮损组下调，而活化的肥大细胞却未在皮损组上调的原因。

本研究利用生物信息学技术对银屑病的表达谱芯片进行了GSEA 及免疫细胞浸润分析，得到了细胞增殖、免疫及癌症相关通路在银屑病中起到重要作用；免疫细胞浸润与目前银屑病发病模型大体符合，巨噬细胞和肥大细胞在银屑病中也起着一定程度的作用的结论。本研究进一步揭示了细胞增殖与免疫细胞在银屑病发病中的重要作用，为银屑病的临床治疗及药物研究提供新的思路。但本研究是根据GEO 数据库中现有的研究数据进行的预测，其中可能会有假阳性或假阴性结论，研究结果尚待进一步实验验证。

作者贡献度说明：

李建红：提供本文思路；李萍：提供本文指导；周扬：撰写论文；周扬、韩露、方如男：共同完成论文相关数据资料的获取和处理；赵艳、郭杨、翟烨：协助完成数据分析和讨论。