基于网络药理学探析鬼箭羽治疗2 型糖尿病潜在分子机制

刘 敏，邱现良，陈 秋

（成都中医药大学附属医院，四川成都 610075）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组以持续高血糖为特征的慢性代谢性疾病，可导致肾脏、眼底、心血管及神经等多个器官和组织的慢性损害及功能障碍。国际糖尿病联盟公布的数据显示，糖尿病已成为继心血管疾病和癌症之后威胁人类健康的第三大杀手［1］。据WHO 最新统计，2012 年DM直接造成150 万人死亡，2014 年全球约有4.22 亿（每11 人中就有1 人）糖尿病患者，是1980 年的14 倍，预计到2030 年糖尿病患者将达到6 亿［2］。抗糖尿病药物如双胍类、磺酰脲类等在临床被广泛应用，但由于“一个靶点，一种药物”的作用机制，它们可能具有相似的副作用，如体重增加、心血管疾病、低血糖和胃肠道反应等［3］。与合成药物相比，中药具有多成分、多靶点联合或协同作用的特点，在DM 治疗中发挥了重要作用［4］。

随着生物信息学的快速发展，整合网络生物学和药理学的网络药理学被认为是一种有前景的更具成本效益的药物开发方法［5］。与传统的“一基因、一药、一病”模式相比，网络药理学注重对疾病的“多靶点、多成分”治疗。它可以揭示多组分和多靶标之间潜在的复杂关系，并提供了系统水平的方法来理解疾病的发病机制［6］，而通过高通量筛选和生物信息学技术，还可建立可行的“药物-靶点-疾病”网络模型［7］，其研究方法的整体性、系统性特点与中医理论中的整体观和辨证原则不谋而合。据报道网络药理学有多种应用，如中药成分靶标/疾病基因预测、网络平衡调控、协同成分对和活性成分组的解析［8-10］。因此，包括网络药理学和网络医学在内的基于网络的方法得到了越来越多的发展和应用。

本研究主要基于数据挖掘分析国医大师张发荣教授的用药经验，张老在临证治疗2 型糖尿病时常于辨治方中加用中药鬼箭羽，每每取得良好的临床疗效。鬼箭羽始载于《神农本草经》，列为中品，其干有直羽如持箭予自卫之状，故又名卫矛。鬼箭羽味苦，性寒，入足厥阴经，具破血通经、散瘀止痛、解毒杀虫之功，主治经闭、症瘕、产后瘀滞腹痛、虫积腹痛等症［11］。现代药理学研究表明其具有降血糖、调血脂、抗动脉粥样硬化、调节免疫等作用，近年来临床多用于治疗糖尿病、高脂血症、动脉硬化及肾脏疾病等［12-15］，效果显著。因此，本研究应用网络药理学研究方法，对鬼箭羽活性成分及作用靶点进行筛选，研究其多成分-多靶点-多通路作用模式，以探索鬼箭羽治疗2 型糖尿病的潜在分子机制。

1 资料与方法

1.1 鬼箭羽主要活性成分及靶点预测

通过检索相关文献和中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获得鬼箭羽主要活性成分，根据外源化学物在人体内吸收、分布、代谢和排泄的动态变化规律，设置口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 及小肠上皮细胞渗透率（Caco-2）≥-0.04 为筛选阈值。同时在TCMSP 数据库提取鬼箭羽所有活性成分的潜在靶点数据，应用Perl（version 5.28.1）筛选出鬼箭羽主要活性成分的对应靶点，为方便后续分析，通过UniProt 数据库在靶点全称后注释其基因名（Gene Symbol）。

1.2 “药物-疾病”共同作用靶点预测

以“Diabetes Mellitus，Type 2”为关键词分别检索人类基因数据库（GeneCards）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM），建立与2 型糖尿病相关的靶点数据集。运用R（version 3.6.3）软件中“VennDiagram”包，对鬼箭羽主要活性成分对应的靶点和2 型糖尿病的靶点数据集进行匹配重合，整合得到药物和疾病的共同作用靶点进行后续分析。

1.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建与分析

应用Perl project 将获取的鬼箭羽主要活性成分的作用靶点和“药物-疾病”的共同作用靶点进行相互映射，可获得网络中每个节点的属性（type.txt），节点之间的连线关系（network.txt）以及药物活性成分列表（molLists.txt）。将以上文件输入Cytoscape（version 3.7.2），以 构 建“药 物-成 分-靶 点-疾病”关系的可视化网络图，其中节点的属性包括药物、活性成分、共同作用靶点和疾病，若经预测成分与靶点之间存在对应关系，则在网络中以边连接。

1.4 “药物-疾病”蛋白互作网络的构建

将鬼箭羽和T2DM 的靶点基因交集上传至STRING 数据库（version 11.0），限定物种为人（Homo sapiens），设置最低要求的相互作用评分为highest confidence（0.900），隐去离散的节点，以获得鬼箭羽治疗T2DM 的蛋白质与蛋白质相互作用网络图（Protein-Protein Interaction，PPI），并 导 出string-interaction.tsv，基于PPI 网络中每个基因连接节点的数目（count 值）筛选出鬼箭羽治疗T2DM 的关键靶点。

1.5 GO 富集分析及KEGG 信号通路分析

应用R 中“org.Hs.eg.db（version 3.10.0）”包，将鬼箭羽与T2DM 共同作用靶点的基因Symbol 转换为基因ID，再安装“Bioconductor（version 3.10）”包对其进行GO（Gene Ontology）生物学过程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路分析，显著性阈值设为P＜0.05，得到鬼箭羽治疗T2DM 靶点的主要生物过程和信号通路。GO 富集分析的结果将以柱状图和气泡图的形式展示，并提供KEGG 通路富集分析的柱状图及信号通路图结果。

2 结果

2.1 药物-疾病交集靶点预测结果

根据方法部分所述，以“鬼箭羽”为关键词检索相关文献及TCMSP 数据库，共获得8 种满足筛选条件的鬼箭羽活性成分和284 个作用靶点，其中作用靶点数目较多的活性成分为槲皮素（154 个）、山奈酚（63 个）和β-谷甾醇（38 个），见表1。以“Diabetes Mellitus，Type 2”分别检索GeneCards 数据库和OMIM 数据库，共获得与T2DM 相关的疾病靶点信息11 750 个，将上述鬼箭羽主要活性成分的作用靶点与T2DM 的疾病靶点数据库取交集，最终得到154 个共同作用靶点。

表1 鬼箭羽主要活性成分数据信息Tab 1 Data information of main active ingredients of Euonymus alatus

2.2 “药物-成分-靶点-疾病”网络图

基于方法部分所述，通过Cytoscape 软件对“药物-成分-靶点-疾病”关系进行可视化，可直观得出鬼箭羽主要成分、T2DM 和作用靶点之间的网络关系。其中红色和蓝色多边形分别代表疾病和药物名称，紫色三角形代表鬼箭羽的主要活性成分，绿色圆形代表鬼箭羽和T2DM 的共同作用靶点，连线代表药物、药物活性成分、疾病及作用靶点之间的相互关系，见图1。结果显示，鬼箭羽的同一活性成分可调控多个靶点，同一靶点与多个活性成分相作用，充分体现了鬼箭羽在治疗T2DM 多成分、多靶点的作用特点。

图1 鬼箭羽的“药物-成分-靶点-疾病”网络Fig 1 Drug-ingredient-target-disease network of Euonymus alatus

2.3 PPI 网络的构建与分析

将鬼箭羽主要活性成分和T2DM 的交集靶点上传至STRING 数据库，构建蛋白与蛋白相互作用关系网络图（PPI），见图2。经计算，PPI 网络中有154 个作用节点，490 条相互作用连线，图中每个节点（Nodes）代表由单个蛋白编码基因位点产生的多个蛋白，节点之间的连线（Edges）代表蛋白互作关系，连线的不同颜色则表示不同的互作证据。图3为基于count 值选取排名Top30 的蛋白质节点，主要包括Jun 原癌基因（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1、MAPK8）、丝 氨 酸/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶（AKT1）、V-Rel 网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、白细胞介素（IL6、CXCL8）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）等。蛋白连接节点的数目越多代表其在整个PPI 网络中互作关系越频繁，提示该蛋白可能是鬼箭羽治疗T2DM 的核心调控靶点。

图2 “鬼箭羽-疾病”靶点相互作用网络Fig 2 Target interaction network of“Euonymus alatus-disease”

图3 鬼箭羽治疗T2DM 的核心调控靶点Fig 3 Key regulatory targets of Euonymus alatus in treating T2DM

2.4 GO 富集分析

对药物-疾病的共同作用靶点进行GO 功能富集分析，共富集到153 条生物过程（P＜0.05）。根据差异基因在GO term 富集的显著性程度（P值），筛选得到前20 条主要生物过程，如图4，其中颜色越红表示富集的显著性越高（P值越小）。这些生物过程主要包括核受体活性、转录因子活性直接配体调节序列特异性DNA 结合、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、DNA 结合转录激活子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、血红素结合等。图5 所示气泡图可显示富集基因数占上传基因总数的比例（Gene Ratio），圆点越大表示占比越大，P值越小则颜色越红，其中比例较大的为DNA 结合转录激活子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、细胞因子受体结合、受体配体活性。表明鬼箭羽治疗T2DM 可能是通过参与以上的生物学调控过程发挥作用。

图4 潜在靶点生物学过程的GO 分析Fig 4 GO analysis of potential targets in biological processes

图5 GO 生物功能富集分析的气泡图Fig 5 Bubble plot for GO biofunctional enrichment analysis

2.5 KEGG 信号通路富集分析

通过R 中“clusterProfiler”包对药物-疾病交集靶点进行通路富集分析，共富集到156 条显著通路（P＜0.05），将P值由小到大排列筛选出前20 条主要信号通路，如图6。通路主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、前列腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、膀胱癌、TNF 信号通路、胰腺癌、IL-17 信号通路、丙型肝炎、人巨细胞病毒感染、肺癌、HIF-1 信号通路、甲型流感病毒、内分泌抵抗等，并与PI3K-Akt 信号通路、NF-κB 信号通路、胰岛素抵抗、AMPK 信号通路、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、胰岛素信号通路、脂肪细胞中脂肪分解的调节等有相关性，表明鬼箭羽活性成分可作用于不同的信号通路综合发挥治疗T2DM 的作用。图7 标注了鬼箭羽主要活性成分在AGE-RAGE 信号通路中的作用靶点。

图6 潜在靶点的KEGG 信号通路富集分析Fig 6 KEGG signaling pathway enrichment analysis of potential targets

图7 鬼箭羽在AGE-RAGE 信号通路中的作用靶点Fig 7 Targets of Euonymus alatus in AGE-RAGE signaling pathway

3 讨论

糖尿病可归属于中医“消渴”或“消瘅”范畴。《灵枢·五变》曰“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆留，髋皮充肌，血脉不行，转而为热，热则消肌肤，故为消瘅”，明确指出了消渴与瘀血之间的关系。《本草备要》载鬼箭羽“苦寒，破陈血，通经”，清杨时泰在《本草述钩元》中谓本品“大抵其功精专于血分”。国医大师张发荣教授认为消渴病“阴虚为本，燥热为标，瘀血为患”，而鬼箭羽味苦善于坚阴，性寒能入血，又长于清解阴分之燥热，对消渴病之阴虚燥热者，每于辨治方中配伍本品15～30 g，能清热止渴，降低血糖和尿糖，屡获良效。且鬼箭羽具破血散瘀之功，对糖尿病并发心脑血管和肾脏、视网膜及神经系统等病变，可改善血液循环，促进新陈代谢，正所谓“通经隧、行瘀血、布津气”，亦可使方中补益药活泼畅荣而不壅腻，实为治疗消渴病之上选药品。

本研究中发现鬼箭羽作用于T2DM 的主要活性成分有8 个，其中作用靶点数目较多的成分为槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇。在对糖尿病大鼠的试验中显示，研究剂量的槲皮素可显著逆转高血糖，降低糖化血红蛋白和肝糖原水平，改善胰腺抗氧化状态，还能预防和治疗慢性高血糖时血红蛋白糖基化相关的继发性并发症［16］，槲皮素还可通过减少iNOS 表达、降低NO 水平及NF-κB 易位抑制等起到保护 胰 岛β 细 胞 的 作 用［17-19］。山 奈 酚 可 激 活cAMP/PKA 通路介导产生促胰岛素分泌作用，还可上调Akt、Bcl-2 蛋 白 的 表 达 和 降 低caspase-3 活 性，保 护胰岛β 细胞不受高血糖诱导的凋亡和功能障碍的影响［20］。β-谷甾醇可增强糖酵解活性，刺激残余β 细胞的胰岛素分泌，增加糖尿病大鼠的肝葡萄糖利用，从而发挥降血糖作用［21］。此外，基于PPI 网络分析得出鬼箭羽主要活性成分有JUN、MAPK1、AKT1、RELA、IL6、MAPK8、EGFR、ESR1、FOS、CXCL8 等多个作用靶点，表明鬼箭羽治疗T2DM具有多成分、多靶点的特点。

GO 富集分析得到153 条生物过程，其中富集结果最显著的是核受体活性（nuclear receptor activity）。核受体在包括发育和代谢稳态在内的关键过程中发挥重要的调节作用，也被称为代谢性核受体。PPARs（亚 型α、β 和γ）是Ⅱ型 核 受 体，在 脂 质 代谢［22］和脂肪细胞分化［23］以及胰岛素反应［24］中发挥重要作用，其中PPARα 活化可导致肝脏和肌肉中脂肪酸氧化增加［25，26］，而PPARγ 活化主要在脂肪组织中增加胰岛素敏感性［27］，这两种途径使PPARs 在血脂异常和糖尿病的治疗中成为重要靶点。研究最多的PPARs 合成配体是噻唑烷二酮类药物（TZD），这类药物甚至在了解其作用机制之前就用于增加胰岛素敏感性，研究发现TZD 可通过活化PPARγ 降低胰岛素抵抗、改变脂肪细胞分化并诱导脂蛋白脂酶（LPL）合成［28-30］，十多年来被有效地用于2 型糖尿病的治疗。贝特类药物通过肝脏中PPARα 介 导 的LPL 活 化 增 加 甘 油 三 酯 脂 解［31］，PPARα 的活化还可通过参与脂蛋白代谢中靶基因的转录变化增加高密度脂蛋白（HDL）水平［32］，这些作用共同改善了致动脉粥样硬化脂蛋白平衡，降低了心血管疾病的发病率。

KEGG 信号通路分析中富集结果最显著的是AGE-RAGE 信号通路。研究表明，晚期糖基化终末产物（AGEs）与其受体（RAGE）结合后可启动一系列受体后信号转导通路，从多个途径参与糖尿病慢性并发症的发生和发展［33］。肾脏在持续高血糖环 境 中 产 生 大 量AGEs 上 调RAGE 表 达，RAGE 的过表达可导致活性氧（ROS）的产生并使炎症加剧，从而促进肾脏慢性炎症状态的建立，最终导致肾脏结构和功能逐渐丧失［34］。Burke 等［35］对猝死于心血管并发症的糖尿病患者的研究中发现，其冠状动脉斑块中RAGE 和EN-RAGE 的表达明显高于非糖尿病患者，RAGE/EN-RAGE 的表达可能进一步损害细胞存活并促进斑块的不稳定。AGEs-RAGE 相互作用还可引起外周神经中致炎基因的转录和氧化应激反应的发生，激活NF-κB，进而促使糖尿病周围神经病变的发生［36］，更有研究显示，在糖耐量减低阶段AGE/RAGE/NF-κB 即已活化［37］。因此，AGE-RAGE 通路可能是鬼箭羽治疗2 型糖尿病及预防相关并发症的重要机制之一。其次根据KEGG 富集分析结果，推测鬼箭羽还具有良好的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等作用，可进一步拓展其临床应用及相关分子机制研究。

综上所述，本研究首次应用网络药理学方法对鬼箭羽治疗T2DM 的潜在分子机制进行了探索，筛选出鬼箭羽8 种主要活性成分及154 个药物-疾病共同作用靶点，并构建了“药物-成分-靶点-疾病”交互网络图，通过富集分析，发现了153 个生物过程和156 条信号通路直接或间接参与治疗T2DM 及相关并发症，体现了中药多成分、多靶点、多途径协同作用的特点。本研究的局限性在于，网络药理学是基于大量数据库所做的预测，数据搜集的全面性及活性成分筛选标准的差异会对研究结果有一定影响，因此后续还需进一步过滤药物活性成分，开展体内或体外实验，并完善中药复方成分的质量评价，为鬼箭羽的临床应用提供科学实用的证据支持，本研究可为后续相关研究提供基础。