稽留流产患者绒毛组织中Netrin-1、DCC、UNC5B和VEGF表达

黄钟慧 韩秋峪

1.徐州医科大学淮安妇幼临床学院(223001)；2.徐州医科大学附属医院

稽留流产(MA)出现在妊娠20周前，胎儿或胚胎已死亡但在宫腔滞留未自然排出[1]。可导致其生育力下降，威胁孕妇的生命安全[2]。近年来子宫胎盘血管循环障碍所致疾病在围产医学领域被重视，有学者对胎儿宫内生长受限(FGR)、子痫前期子宫胎盘循环障碍的影响因子进行了研究[3]，但在早孕稽留流产方面的研究较少。研究证实，血管内皮生长因子(VEGF)、血管肽素(ANG)、纤维母细胞生长因子(FGF)等促血管生成因子皆与胎盘血管产生相关[4]。另有部分新的血管产生调节因子，神经轴突导向因子(Ntrin-1)及其受体结直肠癌缺失基因(DCC)、不协调同源基因5B(BUNC5B)被逐步发现。本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)及免疫组织化学技术(IHC)检测MA绒毛组织中Netrin-1及其受体DCC、UNC5B和VEGF的表达，分析各因子在稽留流产发生中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组

2020年2月-2020年8月本院计划生育科门诊医治并确诊为稽留流产患者30例(稽留流产组)。纳入条件：年龄20～34岁；孕8～12周。平素月经规律，末次月经时间准确；彩超检查诊断：头臀≥7mm，无胎心搏动现象；妊娠囊直径均值≥20mm，无胚胎。宫腔内妊娠无卵黄囊存在，经过2周依然无胚胎与胎心搏动出现。宫腔内妊娠有卵黄囊，经过11d依然无胎心搏动现象[5]；无孕期服用激素类药物经历，术前无米非司酮与米索前列醇药物流产经历。同期非意愿妊娠待行终止妊娠手术的正常早孕女性30例为对照组。所有孕妇均签署知情同意书，本研究得到院伦理委员会同意。

1.2 标本的收集及处理

两组对象术前均完善相关检查，均在静脉麻醉下经腹部超声引导行人工流产负压吸宫术。将吸出绒毛组织快速分离成2份，明确标记后其中1份放入-80℃ 冻存备行PCR检测，另1份4%福尔马林中固定备行IHC。

1.3 实验方法

1.3.1绒毛组织中Nterin-1 mRNA、DCC/UNC5B mRNA、VEGF mRNA的表达采用实时荧光定量PCR检测。按总RNA提取试剂盒说明书步骤提取绒毛组织总mRNA，反转录为cDNA，行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。取PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，取凝胶放入凝胶扫描成像仪，将GAPDH当做标准化内参，定量选择相对Ct法，利用2-△△Ct法求解Nterin-1、DCC/UNC5B、VEGF表达。基因引物序列见表1。

表1 目的基因和内参基因引物序列

1.3.2绒毛组织中Netrin-1、DCC、UNC5B、VEGF的表达采用IHC检测。取4%甲醛固定液固定的绒毛组织，制片、切片、脱水、浸蜡、包埋。采用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，加Netrin-1(1:100)、DCC(1:200)、UNC5B(1:200)、VEGF(1:200)一抗，置4℃湿盒内孵育15h，加酶标二抗，于37℃下孵育20min，加显色剂，复染，脱水，封片；阴性对照，滴加物则由一抗换成PBS，镜检拍照。镜下随机选5个视野，图像染色强度处理使用ImagePro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,USA)分析，IHC染色强度以光密度(IOD)表示，OD值越大阳性反应越强烈。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组一般资料无差异 (P>0.05)。见表2。

2.2 mRNA相对表达量

稽留流产组Netrin-1 mRNA、DCC mRNA、VEGF mRNA的相对表达量低于对照组，UNC5B mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.3 蛋白相对表达量

IHC检测表明，两组Netrin1、DCC、UNC5B、VEGF蛋白相对表达量均存在差异(P<0.05)。见表4、图1～4(1540页)。

表2 两组一般资料比较

表3 两组绒毛组织中各 mRNA相对表达量比较

表4 两组绒毛组织蛋白表达情况比较

3 讨论

近年来稽留流产发病机制的研究在遗传学、免疫学、感染及环境方面有较大进展，而子宫胎盘循环障碍所致的不良妊娠结局引起了广大学者关注。胎盘血管网的良好形成对胎儿宫内发育起着极其重要作用[6]。如果胎盘血管发育不良、血流灌注不足、胎盘微循环障碍则可导致胎盘功能不全、胎盘植入障碍，母体氧气、营养物质、免疫因子等不能通过血管网进入胎儿体内，造成胎儿生长所需物质减少进而导致胚胎发育的停止或死胎等[7]。近年来Netrin-1及其受体DCC、UNC5B在胎盘循环中所起的作用引起较多关注。维持妊娠胎盘的各因子表达相互协调、互相影响，平衡被打破可导致胎盘血管生成不足，增加稽留流产的概率。

本研究对绒毛组织检测显示，与对照组比，稽留流产组Netrin1、DCC、VEGF蛋白及mRNA的表达均降低，UNC5B蛋白及mRNA的表达均增高。Netrins几乎在全部物种的神经系统中都有高度表达。研究表明，Netrins与细胞外基质蛋白层粘连蛋白存在极大的相似性特征[8]。Netrin-1属于Netrins家族成员之一，存在典型的双重导向，当神经细胞轴突生长锥体现受体不同时便能予以激活。从结构划分可将Netrin-1 受体列为两种：第1种为DCC[9]：第2种为UNC5同源物(UNC5H)。有研究推测可能有许多相同的信号因子共同参与了血管机体的神经分布和血管化[10]。胎盘部位并没有神经，不过胎盘绒毛发育期间会形成似神经系统结构，已研究有证实，Netrin-1/Neogenin 轴对细胞的生长发育有一定作用。另外胎盘的三级绒毛血管内皮细胞中有 Netrin-1，对细胞生长起一定作用[11]。有学者对FGR、子痫前期子宫胎盘循环障碍的影响因子Netrin-1及其受体DCC、UNC5B进行了研究，结果显示，Netrin-1及其受体DCC在上述病变的胎盘组织中呈低表达，UNC5B呈高表达，胎盘局部的Netrin -1影响胎盘血管网络的生长可能性较大，会导致胎盘血管面积过小，胎盘供血不能维持胎儿生长导致疾病发生。王君等[12]分析稽留流产绒毛和蜕膜组织，结果提示Netrin-1及其受体DCC的表达受限，而UNC5B高表达，这就意味着Netrin-1及其受体DCC可以作为胎盘血管生长的正性调节因子的概率较大，两者成正相关关系，维持良好的胎盘循环，维持正常妊娠。低表达说明阻止了正常的胎盘循环，可能会造成稽留流产。UNC5B在稽留流产中高表达，说明其可能为负性调节因子，高表达可能抑制了胎盘血管的生长发育，可能会造成稽留流产。VEGF属糖蛋白，对血管内皮细胞有显著影响，是缺氧诱导因子(HIF-1α)靶点。基因VEGF在血管形成过程中主要是通过促进内皮细胞的功能来调控血管发生和生成。VEGF家族是已知的调节胎盘血管生成的重要因素[13]。

Netrin-1、DCC、VEGF属于正性调节因子，能够使胎盘血管内皮细胞发生变化、迁移，维持正常妊娠，其低表达可能导致胎盘血管内皮细胞的增生、迁移受阻，胎盘绒毛血管无法发育完全，导致胎盘血管面积变小，胎盘供血不能维持胎儿正常发育，胎盘血液循环发生障碍，母一胎营养与气体交换无法良性运转，进而可能出现稽留流产。UNC5B为负性调节因子，高表达可以导致血管增生、迁移、侵袭受抑制，胎盘血管循环障碍，导致稽留流产发生。这4个因子均在胎盘血管的形成及发育、胎盘血管重塑方面起一定作用，维持稳定的胎盘血管循环。

本研究也存在不足，仅检测了稽留流产绒毛组织中Netrin-1、DCC、UNC5B和VEGF蛋白及mRNA表达。下一步研究有必要考察稽留流产患者血清中上述因子的表达，如果血清中也存在类似变化趋势，是否可以根据血清内各个因子的表达水平前瞻性地补充因子，以阻止或缓解胎盘循环障碍，预防和治疗稽留流产。上述假说仍有必要开展系统的研究进行验证。

综上所述，稽留流产绒毛组织中Netrin-1、DCC、VEGF蛋白及mRNA表达低于正常孕妇，UNC5B蛋白及mRNA的表达高于正常孕妇，这种异常表达与稽留流产绒毛血管的生成障碍可能有关。