545例NIPT筛查高风险孕妇的产前诊断结果分析

王 贺,肖晓素,西仁娜依

(北京大学深圳医院 检验科,广东 深圳518036)

染色体是人类基因的载体，包括常染色体和性染色体。染色体数目和结构的异常不仅是导致胎儿流产、死胎、发育畸形的常见原因，也是引起新生儿出生缺陷的重要原因之一[1]。目前对于染色体异常所造成的疾病仍无有效的治疗手段，及时通过产前筛查和诊断检出异常胎儿成为预防新生儿出生缺陷的唯一有效途径。传统的产前筛查即孕中期孕妇外周血唐氏筛查，仅对21三体、18三体的筛查有一定的效果，且假阳性率和假阴性率均较高，存在过度产前诊断和漏诊的风险[2]。近年来，母体外周血中胎儿游离DNA的发现和新一代基因测序技术的应用，为无创产前基因检测胎儿染色体异常开辟了新的方向[3-4]。目前，无创产前基因检测技术(non-invasive prenatal testing)以其无创性、高准确性等优势越来越广泛的应用于临床。本研究对北京大学深圳医院因无创产前基因检测阳性并进一步行羊水染色体核型分析的诊断结果进行回顾性对比研究，分析NIPT阳性结果和进行有创性产前诊断的符合率情况，为遗传咨询提供参考。

1 资料与方法

1.1 对象回顾性分析北京大学深圳医院2013年9月至2018年12月接受侵入性产前诊断的孕妇8 850例，其中无创产前筛查(NIPT)高风险的病例共545例，排除双胎妊娠的病例。

1.2 方法

1.2.1NIPT 于孕12-22+6周利用大规模平行测序技术对母体外周血中的游离DNA进行深度测序，进而获取胎儿染色体信息。通过采集5 ml孕妇外周血，提取血浆游离DNA并制备DNA文库，采用BGISEQ500高通量测序平台进行测序(深圳华大基因股份有限公司)，利用生物信息分析与人类基因组参考序列进行比对，得出胎儿患染色体异常的风险。

1.2.2羊水标本采集 NIPT阳性的孕妇进行产前遗传咨询，在知情同意的原则下于孕18-22+6周行羊膜腔穿刺术，采集羊水标本20 ml进行产前诊断分析。

1.2.3羊水细胞核型分析 按照常规羊水细胞培养7-10天，收获前1 h用秋水仙素处理，制片，进行G显带确诊,C显带进一步验证，每例随机镜检计数30个分裂相，嵌合体病例计数100个分裂相。分析3-5个核型，异常者加倍计数与分析并根据ISCN2013人类细胞遗传学国际命名体制命名。

1.2.4染色体微阵列分析(CMA) 采用Affymetric公司提供的高分辨率全基因组CytoScan HD芯片，按公司提供的操作流程进行检测。参考国际公开数据库(DGV database、Decipher database以及OMIM等数据库)对拷贝数变异(CNV)进行判断分析。

1.3 统计学方法计数资料采用χ2检验，比较检出率的差异，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 NIPT高风险孕妇产前诊断符合率分析

在545例NIPT高风险的孕妇中，21-三体165例、18-三体67例、13-三体41例、性染色体数目异常202例、常染色体数目异常49例、缺失或重复序列超过10 Mb的结构异常病例21例(表1)，针对上述NIPT高风险不同异常类别的病例，通过利用有创性的产前诊断胎儿羊水细胞核型(金标准)分析后发现，核型分析阴性例数分别为19例、24例、32例、87例、45例和16例，其假阳性率分别为11.5%、35.8%、78.0%、43.1%、91.8%和76.2% 。进一步统计分析发现NIPT筛查对13-三体检测的假阳性率显著高于21-三体和18-三体(P<0.05)。

2.2 嵌合型病例分析

通过进一步的核型分析我们发现，545例NIPT高风险孕妇患者中有22例羊水细胞核型分析结果表现为嵌合型(表2)，包括3例21-三体、2例18-三体、18例性染色体数目异常和4例常染色体数目异常。其中，3例表现为+mar及+mar的嵌合型，2例为18-三体和1例性染色体数目异常，利用染色体微阵列分析(CMA)检测分析，确证了+mar为相应染色体的部分片段。

表2 22例嵌合型NIPT高风险病例的核型表现

3 讨论

随着我国二胎政策的推进，高龄产妇比例随之升高，生育染色体缺陷患儿风险不断增加。有效的产前筛查和诊断是预防出生缺陷的重要措施。伴随新一代高通量测序技术的迅猛发展和成本降低，基于孕妇外周血胎儿游离DNA的无创产前筛查技术，以其安全、便捷快速准确等特点，其临床应用不断深入[5]。 NIPT对常见的唐氏综合症(21-三体)、爱德华综合征(18-三体)和帕陶氏综合征(13-三体)的筛查有效性得到一致认同[6-7]。然而，其临床实践中出现的假阴性及假阳性问题也不断被认识。本研究中通过对545例NIPT高风险患者进行分析，结果提示21、18、13-三体的假阳性率分别为11.5%、35.8%和78.0%，与路兴军等[8]的研究基本相符。从阳性预测效能上可以发现，NIPT对21-三体和18-三体的检测效能要高于13-三体，究其原因可能与13号染色体中鸟嘌呤及胞嘧啶脱氧核苷酸的含量较低有关，容易导致测序时产生偏差[9]。

NIPT技术的核心原理是基于血浆游离DNA全基因组测序，因此对其他染色体非整倍体及其他异常理论上也可检出，目前已有相关实验室将其拓展至全部染色体的检测。然而，其检测效能和假阴性及假阳性率问题仍然存在争论[10]。本研究中，NIPT阳性患者中发现202例性染色体数目异常、49例常染色体数目异常及21例大片段结构异常，经羊水细胞核型分析后发现NIPT针对上述异常的假阳性率分别为43.1%、91.8%和76.2%，与相关文献报道基本相符[11-12]。此外，我们还发现22例嵌合体病例，涉及21-三体、18-三体、性染色体数目异常，其中性染色体异常嵌合体病例最多。值得关注的是，胎儿性染色体的异常与前述常见染色体非整倍体(21、18、13-三体)相对，其表型多轻微，孕期超声表现也不易发现异常，因此针对这类胎儿的检测需要更准确、可靠的测试手段。NIPT筛查性染色体异常容易出现假阳性，其原因包括：1)两条性染色体的同源性高不利于分辨；2)X染色体的鸟嘌呤及胞嘧啶含量偏移，Y染色体存在大量相似片段使得测序信噪比降低，不利于分辨；3)母体本身存在拷贝数异常干扰，以及胎儿染色体存在的嵌合现象[13-14]。因此，针对NIPT高风险提示的性染色体异常的病例，利用羊水细胞核型分析及其它性染色体分析检测技术如FISH、CMA等对于患者的产前诊断结果的确诊具有重要意义。本研究中，我们针对3例NIPT阳性病例羊水细胞核型分析表现为+mar或+mar的嵌合型，采用了CMA分析验证。CMA结果均证实来源于相应染色体的部分片段。很好的体现了CMA对于核型分析及NIPT结果完善的重要意义。

综上所述，无创产前基因检测(NIPT)对于21-三体及18-三体的检测具有较高的敏感性和较高的阳性预测价值，而对于13-三体、性染色体数目异常及大片段的结构性畸变则存在一定的假阳性率。对于NIPT筛查高风险的病例还需进行有创性的产前诊断来确诊。此外，完善孕妇本身的外周血核型分析及利用染色体微阵列分析(CMA)和FISH等检测手段对于产前诊断的完善具有重要的临床意义。