载脂蛋白D 对神经干细胞增殖的作用

赵琦琦,李奕昕,焦倩,姜宏

(青岛大学国家生理学重点(培育)学科,山东青岛 266071)

神经干细胞(NSCs)是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[1-4]。由于NSCs在特定条件和因子诱导下可以定向分化成不同类型神经细胞,NSCs移植可以弥补丢失的神经元,成为神经系统疾病细胞替代治疗的可行性方案之一,为神经系统退行性疾病和神经损伤等提供了新的治疗策略[2,4-5]。因此,对NSCs增殖、分化调控的研究是揭示临床上常见中枢神经系统发育缺陷疾病致病机制的关键,同时也为一些神经障碍疾病的治疗提供新思路。

载脂蛋白D(Apo D)1963年首次发现于血浆高密度脂蛋白(HDL)中,是具有脂质转运功能的分泌型糖蛋白[6]。Apo D 是一种分子量为29 000的糖蛋白,作为载脂蛋白家族成员之一,其在体内分布广泛,在肾脏、脾脏、睾丸和大脑中均具有高水平的表达[6-7]。在人类和其他哺乳动物中枢神经系统中,Apo D 主要表达于胶质细胞及其前体[8-9],也可由神经元表达[10]。Apo基因是在衰老的大脑、神经退行性疾病和精神疾病中始终过量表达的少数基因之一[10-12]。大量研究结果表明,在衰老和多种神经系统功能失调疾病中Apo D 的含量明显增高[10-11,13],Apo D 的增加主要见于星形胶质细胞、神经元和损伤区的少突胶质细胞。相关研究已表明,在衰老或病理条件下的果蝇模型中,Apo D 可降低体内因活性氧积累而升高的脂质过氧化物水平[14]。本实验室前期研究显示,Apo D 对多巴胺能神经元具有神经保护作用,其保护作用可能与抗氧化应激有关。但Apo D 对NSCs增殖的作用未见报道。故本研究通过体外培养大脑皮质NSCs、外源性给予Apo D 的方法,观察不同浓度的Apo D 对大脑皮质NSCs细胞活力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),Apo D(Biovendor 公司),DMEM/F12培养液(Hyclone公司),表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、N-2 supplement、B-27 supplement和胎牛血清(Gibco公司),cell counting kit(CCK-8)试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大脑皮质NSCs的分离培养 取孕14 d的C57BL/6小鼠胚胎大脑皮质部位组织,机械剪碎和吹打后过滤离心,细胞计数后种植在75 cm2的培养瓶中,置于温度37 ℃、含有体积分数0.05 CO2的孵箱中,使用含有DMEM/F12(1∶1)、体积分数0.02 N-2 supplement、体积分数0.01 B-27 supplement、10μg/L bFGF、20μg/L EGF、10 g/L青霉素-链霉素混合液的完全培养液进行培养。NSCs培养4～5 d时进行传代,传代至第3 代时,以1×106/L 密度种植于多聚赖氨酸包被的玻片上,使用含体积分数0.01胎牛血清的分化培养液诱导分化,7 d后经预冷的40 g/L多聚甲醛固定30 min,免疫荧光染色后观察NSCs分化情况。

1.2.2 NSCs的鉴定 NSCs贴壁培养7 d后,用多聚甲醛固定细胞,加入含体积分数0.01山羊血清的封闭液,室温封闭1 h;加入Nestin、Ki67、β-tubulinⅢ和GFAP 抗体,4 ℃孵育过夜;用0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min;加入荧光二抗室温孵育1 h,DAPI室温染色5 min;用0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min;封片,荧光显微镜下观察并拍摄荧光图像。

1.2.3 细胞活力检测 将第3代的皮质NSCs传代种植于96孔板,每孔100μL,种植密度为1×105/L,以不同浓度(0、2、4、8、16 和32 nmol/L)Apo D培养5 d,检测第5天时的NSCs细胞活力。在测定前2～4 h,每孔加入10μL 的CCK-8溶液,于酶标仪(Perkin Elmer,Victor nivo)上检测,以450 nm 波长处的吸光度(A)值反映细胞活力。

1.2.4 神经球直径测量 将传至第3代大脑皮质NSCs以1×108/L密度种植于96孔板内,培养1～5 d,于光镜下观察并拍摄图像。利用NIS-Elements软件测量培养1～5 d形成的神经球直径。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果以±s表示,多组比较采用单因素方差分析,继以Tukey法进行组间两两比较;两组比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSCs的培养与鉴定

大脑皮质NSCs培养3 d时可增殖成直径40～70μm 的神经球;培养5 d时可增殖为直径100～150μm 的神经球(图1A)。神经球免疫双标染色结果显示,Nestin和Ki67阳性(图1B、C)。大脑皮质NSCs诱导分化7 d后,出现β-tubulin Ⅲ阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞(图1D)。

图1 体外培养NSCs的鉴定

2.2 Apo D 对NSCs细胞活力的影响

NSCs经2、4、8、16和32 nmol/L 的Apo D 培养5 d,检测细胞活力的A 值分别为0.195±0.005、0.181±0.004、0.188±0.004、0.185±0.005和0.167±0.005。与对照组(0.150±0.003)相比较,2、4、8、16和32 nmol/L Apo D 处理组NSCs细胞活力均显著增高,差异具有统计学意义(n=5,F=37.66,P＜0.001),其中2 nmol/L Apo D 处理组NSCs细胞活力增高最明显,表明低浓度Apo D 对NSCs细胞活力的影响较高浓度Apo D 显著。见图2。

图2 Apo D对NSCs细胞活力的影响

2.3 Apo D 对神经球直径的影响

NSCs经2 nmol/L Apo D 培养5 d,神经球直径为(55.142±0.393)μm,与对照组的(49.912±3.256)μm 相比,2 nmol/L Apo D 处理组NSCs形成的神经球直径增大,差异有统计学意义(n=6,t=2.841,P＜0.05)。

3 讨 论

NSCs具有自我更新和多向分化潜能。当神经退行性病变或中枢神经系统受到损伤时,NSCs会向损伤部位迁移并替代受损细胞[15],从而在很大程度上恢复功能,这为中枢神经系统疾病的治疗带来了希望的曙光。但是,由于成人内源性NSCs很少,这种内源性激活显然不足以达到治疗目的。因此,NSCs的增殖研究成为细胞治疗的一个关键问题。

体外培养的小鼠胚胎大脑皮质NSCs可增殖形成神经球,且随着培养时间的延长,细胞数量增多、体积增大。本研究免疫荧光染色结果显示,NSCs培养至第5天时,神经球内细胞呈Nestin阳性,说明分裂增殖的NSCs仍具有祖细胞的特性。此外,NSCs还有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。本研究免疫荧光染色结果显示,体外培养的小鼠胚胎大脑皮质NSCs经诱导分化7 d后,出现β-tubulinⅢ阳性和GFAP 阳性细胞,提示NSCs分化为神经元和星形胶质细胞,证实了大脑皮质NSCs的多向分化潜能。

NSCs的增殖受多种因素的影响,除受内在基因的调控外,还受周围包括细胞因子等微环境的影响[2,16-17]。Apo D 是血浆HDL的一种成分,在人类胎盘、卵巢、睾丸、脑、胰腺和肾上腺中表达水平较高[18],在老年人的神经胶质细胞和老年病病人的神经元中丰富表达[9,19]。既往研究表明,Apo D 参与免疫反应、细胞凋亡、胚胎的发育和分化、神经系统的发生和损伤修复以及肿瘤发生等生命活动和过程[12]。Apo D 缺陷小鼠对氧化应激的敏感性及脑脂质过氧化的水平明显增高,而Apo D 过表达小鼠存活率增高并能抑制氧化剂作用后脑脂质过氧化物的增加[20],表明Apo D 在应激应答中起保护作用,这可能与抗氧化有关。此外,在神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)病人的周围神经再生部位和脑脊液中Apo D 也高浓度表达,提示Apo D 可能参与中枢神经系统和周围神经系统的保护和修复[6]。本研究结果证实,不同浓度Apo D 均可显著提高体外培养的大脑皮质NSCs细胞活力。Apo D 对大脑皮质NSCs细胞活力的影响并不具有浓度依赖的特点,这可能是由于不同浓度的Apo D 对神经系统或细胞产生不同生理效应导致的。Apo D 对神经系统的具体作用还需要进一步的研究。

综上所述,Apo D 可以提高NSCs的细胞活力,增强细胞的存活和增殖能力,进而影响神经再生。