慢性骨髓炎感染屏障的机理研究

谢丹 林振恩 廖才杰 林志文 周腾祥 许金言

慢性骨髓炎病程长，病情迁延，一直是临床治疗过程中一个棘手的难题。虽然抗菌治疗在大多数感染性疾病中应用效果较好，但由于骨骼的特殊生理和解剖特点，慢性骨髓炎治疗仍然十分困难。研究显示，抗生素在病灶内达到并保持有效抑菌浓度对于治疗的成功至关重要[1]。目前研究及临床中更多的是通过改进局部给药的方法，提供持续的药物浓度，来提高治疗骨髓炎疗效。但骨髓炎常规用药途径疗效不佳，机理尚不清楚。有人认为是细菌分泌合成胞外多聚物，即细菌生物膜覆盖于组织表面抵御抗生素的作用和机体的免疫反应，但这一认识仍然无法解释慢性骨髓炎相较于其他组织慢性炎症对于抗生素等治疗更不敏感性的原因。本研究试图从另外的角度做一探讨，即探讨微血管是否是慢性骨髓炎病理过程中的屏障及治疗过程中的瓶颈。本实验采用开窗注入金黄色葡萄球菌法制成慢性骨髓炎兔模型，观察病理情况下微血管密度（microvessel density，MVD）的变化及髓内植入万古霉素骨水泥对髓腔内金黄色葡萄球菌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金黄色葡萄球菌ATCC 6538（广东环凯生物），5%鱼肝油酸钠注射液（上海东海制药厂，每支2 mL∶0.1 g）。鼠抗兔CD34单抗（abcam公司，英国）；骨水泥（强生公司，美国）。

1.2 分组和造模

健康雄性成年新西兰大白兔30只，体质量（2.50±0.3）kg，清洁动物，由福建中医药大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2014-0006。随机分成分为三组：假手术组10只，慢性骨髓炎模型组10只，万古霉素骨水泥组10只，术前适应性饲养7 d。慢性骨髓炎模型制作方法[2]：将兔以乌拉坦静脉麻醉，麻醉成功后取右胫骨内侧纵切口3 cm，切开皮肤、皮下组织，显露右胫骨近端内侧，剥离局部骨膜后用3 mm钻头的手钻在该处钻2个纵向相连、部分重叠的骨洞，用小刮匙刮除松质骨，修整骨洞边缘，制成6 mm×3 mm的矩形骨窗，于骨窗内注入金黄色葡萄球菌0.1 mL，金黄色葡萄球菌使用前以比浊仪生理盐水稀释成1×108cfu/mL，无菌骨蜡封闭骨窗，生理盐水冲洗后缝合伤口，术后继续回笼常规喂养4周。4周后慢性骨髓炎模型组和万古霉素骨水泥组检测骨窗细菌培养阳性证实造模成功。假手术组动物单纯以上述方法造成骨窗，不予金黄色葡萄球菌注入，慢性骨髓炎模型组植入骨水泥，万古霉素骨水泥组植入万古霉素骨水泥，再经过4周后，各组动物取胫骨感染段骨质进行指标检测。

1.3 万古霉素骨水泥植入件制作

按马金超法[3]将聚甲基丙烯酸甲酯以一定比例混合制作成长6 mm、宽3 mm、高3 mm长方体植入件，含万古霉素（0.024±0.002）g，室温下保存放置24 h，予环氧乙烷消毒2 h后备用。

1.4 组织学观察

在兔胫骨近端取出万古霉素骨水泥植入件后，截取胫骨骨窗横断面，4%甲醛溶液固定，脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察三组骨髓微血管情况。对每张切片进行骨髓MVD计数：低倍镜（100×）视野下选出血管最丰富的3个不相连区域，然后在高倍镜下（400×）计数3个热点（微血管密集区hot spot）的微血管数，取其平均值即为MVD。任何呈棕黄色阳性的内皮细胞或内皮细胞簇，且与邻近血管和骨小梁清楚分开者为1个能够计数的血管。

1.5 免疫组织化学染色检测骨髓MVD

石蜡切片经脱蜡和水化后，按免疫试剂盒说明书加一抗鼠抗兔CD34单克隆抗体、二抗通用型标记IgG、辣根过氧化物酶标记、DAB显色、复染、脱水、封固等步骤，在显微镜下观察CD34阳性染色微血管情况，血管内皮细胞的细胞质呈棕黄色为阳性染色[4]。在低倍镜视野（100×）下计数新生骨区域CD34表达阳性的微小血管，记录5个视野内微小血管数，取其平均值作为MVD值。然后在高倍镜下（400×）计数3个热点（微血管密集区hot spot）的微血管数，取其平均值即为MVD。任何呈棕黄色阳性的内皮细胞或内皮细胞簇，且与邻近血管和骨小梁清楚分开者为1个能够计数的血管。高倍镜下（200×）计数5个视野中的微血管数，取其均值。结果判断标准：胞质内出现棕黄色颗粒的阳性细胞数＜5%为阴性，5%～25%为弱阳性，>25%为强阳性；微血管密度的判定参照weidner标准[4]。

1.6 骨髓细菌量检测

截取胫骨骨窗骨断面组织进行称量，置于无菌匀浆器内，加入适量生理盐水，使其成10-1稀释度（W/V）。在恒速下进行匀浆，将内管上下移动使组织充分搅碎，然后按一定浓度将稀释液接种及琼脂培养基上，培养48 h（恒温37°C）而后取出统计细菌落数，计数细菌总数，即得每克组织的细菌数[5]。每克骨细菌数（cfu/g）=同一稀释度的平均菌落数（cfu）×稀释倍数。

1.7 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验；计量资料以（）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察

假手术组可见髓内微血管内膜光滑，血管腔未见狭窄，内皮细胞结构正常，内皮细胞、内弹性膜、中层平滑肌细胞均排列整齐，胞质呈嗜酸性红染，细胞核形态正常。慢性骨髓炎模型组可见出现严重骨质破坏，脓液穿透骨质，髓腔内黄白色脓液形成；可见死骨形成及大量炎性细胞浸润，微血管管腔不规则狭窄，内膜增厚，内皮细胞、内弹性膜、中层平滑肌细胞排列紊乱，血管周围组织可见明显炎症改变。万古霉素骨水泥组较模型组微血管病变程度轻，内膜较光滑，但与假手术组比较，内皮细胞排列不整齐，细胞核形态不规则。

2.2 各组MVD计数比较

与假手术组比较，慢性骨髓炎模型组MVD明显下降，比较差异有统计学意义（P＜0.05），分布较为稀疏；与慢性骨髓炎模型组比较，万古霉素骨水泥组在4周后MVD明显上升，比较差异有统计学意义（P＜0.05），万古霉素骨水泥组与假手术组相比差异无统计学意义（t=1.31，P＞0.05），见表1。

表1 各组MVD计数比较（个/HP，）

表1 各组MVD计数比较（个/HP，）

注：*与假手术组比较，#与慢性骨髓炎模型组比较

2.3 慢性骨髓炎模型组和万古霉素骨水泥组感染段骨髓4周后局部金黄色葡萄球菌残留菌量比较

与慢性骨髓炎模型组比较，万古霉素骨水泥组经4周髓腔植入万古霉素骨水泥治疗，感染段骨髓金黄色葡萄球菌残留菌量呈现显著性下降，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 慢性骨髓炎模型组和万古霉素骨水泥组感染段骨质4周后局部金黄色葡萄球菌残留菌量比较（cfu/g，）

表2 慢性骨髓炎模型组和万古霉素骨水泥组感染段骨质4周后局部金黄色葡萄球菌残留菌量比较（cfu/g，）

3 讨论

在骨感染的抗生素治疗上，有针对性的治疗和高效率的治疗一直是两个关键的环节[6-7]。前者依赖于药物敏感性试验，并选择适当的抗生素。后者则依赖于药物递送系统的通畅。机体的血管系统是体内药物递送的主要途径，微血管系统是药物通达器官的最后通路，各种生理病理因素均可影响药物作用。如果微血管系统不通畅或者病变，向骨髓内的递药也将中断。微血管密度是指生物组织中单位面积的微血管数量，近年来常用来作为评价组织局部血管生成或破坏的量化指标。肿瘤患者的血管生成研究一直临床研究热点，但是，其他如慢性骨髓炎的微血管密度情况及其对临床的意义仍然缺乏深入的认识。从慢性骨髓炎的发病过程来看，细菌侵入骨骼，诱发机体的炎症反应，局部产生了大量的炎性因子、破骨细胞，造成了炎性细胞的浸润，这些破坏性细胞及分子对于微血管也产生了很大的影响[8-9]。本实验对骨MVD的检测显示慢性骨髓炎的MVD较正常处于下降状态，这可能反映了慢性炎症对微血管的破坏性，这将导致机体自然递药过程的低效。微血管密度的研究对于慢性骨髓炎治疗方法的促进具有启示意义，很好地解释了敏感的抗生素仍然无法达到骨髓内MIC浓度，故病情迁延不愈、窦道反复流脓。这可能是慢性骨髓炎面临治疗屏障的又一机理。

当然，细菌产生生物膜的问题，则是影响慢性骨髓炎疗效的另一机理。为了寻求髓药浓度大幅提升，增强抗菌效能，使用载体系统髓内植入作为局部递送抗生素的介质来治疗骨髓炎的情形近年来越来越普遍。这种输送系统可在感染部位持续提供较高浓度的抗生素，并降低毒性和耐药性[10-12]。PMMA骨水泥是常见的一种载体，研究证实，这种载体是骨髓炎药物治疗的有效选择。本文中万古霉素骨水泥组就是以髓内递药的方式使髓腔内达到并保持有效抑菌浓度才可能将感染段骨质中残留金黄色葡萄球菌数减至最低的。当然，最佳剂量和更均匀的释放仍然有待进一步的研究。

慢性骨髓炎微血管密度降低，血管数减少与细菌在病灶中残留数呈负相关，笔者认为，抗生素通过微血管进入骨髓内的效能降低是慢性骨髓炎治疗迁延的机理之一，是骨髓炎治疗中的一个病理障碍，因此，通过清创、局部使用抗生素或使用促血管生成的药物等方法或将有为缩短慢性骨髓炎治疗时间和防止复发提供新的思路和方法。