生态环境和基因型对成熟期雪茄烟叶际真菌群落的影响

邢蕾，刘仡，刘杰，李品鹤，胡希，徐恒，刘路路，周文，易镇邪

1 湖南农业大学农学院，湖南省长沙市 410128；

2 四川中烟工业有限责任公司长城雪茄烟厂，四川省什邡市 618400

微生物生长的叶表面称为叶际，叶际是植物叶面组成的独立微生境[1-2]。生活在叶际的细菌、真菌、藻类等微生物称为叶际微生物。叶际由于长时间接受太阳紫外线照射、遭遇单日温湿度剧烈波动，降水的冲刷，加之能被利用的养分又极少，长期以来被认为是一个不利于微生物定殖的生境。也有研究发现，叶际定殖着丰富的微生物种群，并具有多种生物学功能[3-5]。随着检测技术的发展，发现叶际存在数量庞大的微生物，每平方厘米鲜叶表面微生物数量高达106～107个[6-7]，具有提高植物的抗病[6-7]、抗虫[8-9]、固氮[10-11]、分解有毒有害物质[12]、产生激素促进植物生长等多种生态功能。

雪茄香气浓郁、吸味丰满，国内雪茄市场日趋成熟，雪茄正从炫耀性消费向需求性消费转变，2013年至今雪茄销量每年均保持较快的增长速度。据统计，2020 年国产手工雪茄累计实现销售1224 万支，同比增长121%。优质雪茄烟叶是雪茄工业的命脉，其质量直接决定雪茄品质的高低[13]。微生物在烟叶原料生产过程中扮演着重要角色[14]。研究表明微生物能促进烟叶发酵、缩短发酵周期，改善烟气劲头和刺激性，提高香气质和香气量，提升烟叶品质。在烟叶调制期间，烟叶的霉烂和TSNAs 的积累与微生物有着重要的关联。相较于烤烟采收后的高温烘烤，雪茄烟叶采收后的调制主要通过晾晒和自然发酵完成，调制相对温和。大田成熟期叶际真菌能更好保留至调制和发酵阶段，并发挥重要功能。真菌既是叶际微生物的重要类群，又参与烟叶品质的形成。但迄今为止，雪茄烟叶大田成熟期叶际真菌菌群特征及其形成机理却知之甚少。深入了解生态环境、基因型与叶际真菌群落结构的内在联系对雪茄种植、品质调控都有重要意义。因此，本研究以成熟期雪茄烟中部叶为材料，采用高通量测序技术研究生态环境和基因型对叶际真菌群落结构的影响，揭示雪茄烟叶际真菌与生态环境和基因型的内在联系，以期为发掘和利用叶际真菌资源提供科学依据，为优质雪茄烟叶生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点位于海南儋州光村（GC.）和五指山（WZS.）雪茄种植基地。儋州光村的土壤有机质11.84 g/kg，全氮0.53 g/kg，全磷0.45 g/kg，全钾1.16 g/kg，水解氮76.66 mg/kg，有效磷32.55 mg/kg，速效钾48.15 mg/kg。五指山的土壤有机质23.33 g/kg，全氮1.48 g/kg，全磷1.32 g/kg，全钾25.85 g/kg，水解氮123.37 mg/kg，有效磷35.64 mg/kg，速效钾93.34 mg/kg。

1.2 栽培方法

选择3 个不同基因型且抗病性和株型较一致的雪茄茄芯品种海研101（M1）、海研201（M2）、海研109（M3），试验地选择产量适中、土壤肥力中等且均匀、无病虫害的烟田。供试肥料为烟草专用复合肥和专用追肥，复合肥60%作基肥大窝圈施，剩余40%肥料在移栽后20 d 一次性追施。施氮量180 kg/hm2，养分比例为N: P2O5: K2O= 1: 1: 3。每个处理设3 个小区，每个小区90 m2，株行距40 cm×100 cm，其他田间管理措施按照当地种植技术进行。

1.3 样品采集

于2019 年4 月17 日雪茄烟叶成熟期采集完整、无病虫害的中部烟叶，每个小区随机选18 株，每6株的中部烟叶3 片作为一个样品，每个样品100 g。用灭菌镊子将叶片装入灭菌的封口袋，置于4℃ 冰盒暂存，带回实验室后储存于4℃冰箱中。

1.4 叶际真菌总 DNA 提取与测序

在无菌台上将采集的中部叶样品剪成1 cm 左右的小叶片，按样品混合均匀后称取10.00 g 叶片，置于装有无菌水的三角瓶中室温下摇床上振荡 30 min，200 r/min，结束后40 kHz 超声处理15 min。无菌操作下，采用真空抽滤装置将微生物收集于0.22 μm 滤膜上。参考Griffith 的方法，采用CTAB 法提取叶际真菌总DNA。利用Illumina NovaSeq 测序平台对真菌18S rRNA 基因转录间隔区ITS1-1F 进行PCR 扩增，引物序列为ITS1-1F-F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS1-1F-R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[15-17]。

1.5 数据处理

使用FLASH V1.2.7对每个样本的reads进行拼接，运用QIIME V1.9.1对数据进行严格的质量控制，用Uparse v7.0.1001 （http://www.drive5.com/uparse/）对所有样本的全部 Effective Tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，用Qiime软件（Version 1.9.1）中的blast方法（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）与Unit(v8.2)数据库（https://unite.ut.ee/）进行物种注释。使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree 指数，使用R软件（Version 3.62）绘制稀释曲线，并使用R软件进行Alpha多样性分析；运用SPSS22.0分析生态环境、基因型及其交互作用与叶际真菌的影响[18-20]。

2 结果

2.1 OTU 聚类及物种注解

由图1 可知，各样品的测序深度为40000 时趋于饱和，稀释曲线趋于平缓，已涵盖样品中的绝大多数物种，增加测序数据亦不能再找到更多的OTU。因此，本次试验的测序深度已覆盖各样品中的绝大多数物种，测序数据量可以表征雪茄烟叶叶际真菌的特征和多样性。由图2 可知，6 个烟叶样品中共有1473 个特异性OTU，172 个共有OTU，占总数的11.68%，且光村生态区的OTU 数量是五指山生态区的3.07 倍。三个雪茄基因型中以M3 的OTU 数量最高。三种基因型的雪茄烟在光村和五指山种植，同一基因型不同生态环境的烟叶样本OTU 数量表现明显的差异，GC.M1 与WZS.M1 具有345 个共有OTU，GC.M1 有319 个特异性OTU，WZS.M1 有242 个特异性OTU；GC.M2 与WZS.M2 有349 个共有OTU，GC.M2 有412 个 特 异 性OTU，WZS.M2 有287 个特 异 性OTU；GC.M3 与WZS.M3 具 有426 个 共 有OTU，GC.M3 有1024 个 特 异 性OTU，WZS.M3 的特异性OTU 为280 个。

图1 OTUs 稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curve of OTUs

图2 基于OTU 的Venn 图Fig. 2 Venn diagram based on OTUs

2.2 叶际真菌多样性比较

如表1所示，各处理的叶际真菌测序文库构建良好，覆盖度均达到 99% 以上。测序结果具有较好的代表性。Alpha多样性分析表明Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数范围分别在2.43～4.20、0.54～0.85、316.96～610.66、313.67～613.52。方差分析表明GC.M3的Shannon、Chao1和ACE指数显著高于WZS.M1～WZS.M3（P<0.05），Simpson指数极显著高于WZS.M1～WZS.M3（P<0.01）。GC.M3的Chao1和ACE指数显著高于GC.M1（P<0.05）。

表1 叶际真菌Alpha 多样性指数Tab. 1 Alpha diversity indices of phyllospheric fungi ( mean±SD, n = 3)

2.3 叶际真菌菌落组成

由图3（A）可知，雪茄烟中10个优势叶际真菌门分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、罗 兹 菌 门（Rozellomycota）、 球 囊 菌 门（Glomeromycota）、捕虫霉门 （Zoopagomycota）、油 壶 菌 门（Olpidiomycota） 和 梳 霉 门（Kickxellomycota ） 。各样品中隶属于上述10个优势门的真菌OTU量之和均超过总 OTU 的97%。10个优势门中，各烟叶样品均以子囊菌门（Ascomycota）含量最高，担子菌门（Basidiomycota）次之，其OTU数量占总OTU数量分别为53.85%～91.69%，19.99%～44.46%。

由图3（B）可知，1 0 个优势叶际真菌属分别是枝孢属（Cladosporium），桑帕氏酵母菌属（Sampaiozyma）、尾孢菌属（Cercospora）、链格孢属（Alternaria）、被孢霉属（Mortierella）、红菇属（Russula）、黑团孢属（Periconia）、子囊菌属（Archaeorhizomyces）、赤霉属（Gibberella）和假尾孢属（Pseudocercospora）。GC.M1和GC.M2的上述10个优势叶际真菌属OTU数量均超过总OTU的89%，GC.M3的OTU超过82%，WZS.M1～WZS.M3的OTU均超过93%。

图3 叶片真菌群落中10 个优势门（A）和属（B）的相对丰度Fig. 3 Relative abundance of 10 dominant genera in phyllosphere fungi at the phylum (A) and genus (B) level

2.4 两生态区不同生育期气候比较分析

光村海拔高度为51.6 m，五指山为海南省海拔最高地，为154 m。本研究利用小气候收集器，记录了大田生长期的气候变化。由表2可知光村和五指山的温度相差较小，但湿度有明显的差异，在成熟期两地温度均达到大田生长期最高；整个大田生长期光村的湿度均大于五指山；五指山降水总量高于光村，还苗期、伸根期、旺长期两地降水总量差距不大，但在成熟期，五指山降水总量为光村的1.57倍；还苗期、伸根期、成熟期，五指山平均光合有效辐射量均高于光村，旺长期则是光村略高于五指山。

表2 两生态区不同生育期气候差异Tab. 2 Climate differences in different growth stages of two ecological regions

2.5 叶际真菌群落变化主要影响因素分析

由表3可知，雪茄烟成熟期叶际真菌群落中属水平受生态环境、基因型及其二者交互作用的显著影响。方差分析表明枝孢属相对丰度受生态环境和基因型的影响分别达到极显著水平（P<0.01）和显著水平（P<0.05）；桑帕氏酵母菌属受生态环境的影响达到极显著水平（P<0.01），受生态生境-基因型交互作用影响达到显著水平（P<0.05）；赤霉属和假尾孢属受生态环境的影响达到极显著水平（P<0.01）。如图4所示，基于weighted Unifrac距离的PCoA分析表明第一主成分和第二主成分分别解释了77.30%和15.42%的变异；五指山和儋州光村两个生态区的叶际真菌能较好的分离。因此，生态环境对叶际真菌群落结构的影响更为显著。

表3 叶际真菌群落结构影响因素的多因子方差分析Tab. 3 Multi-factor variance analysis of the factors influencing phyllosphere fungal community structure

图4 叶片真菌PCoA 分析图Fig. 4 PCoA plots of phyllospheric fungi

3 讨论

文章物种群落组成的结果表明，三个不同基因型的雪茄烟叶际真菌物种的组成较为丰富。在门水平上，三个不同基因型的雪茄烟叶的优势菌门主要为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota），有研究指出子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）的菌群在真菌界中占比高至98%[21]，且子囊菌门物种高于担子菌门2倍以上[22]，本文的研究结果与前人结果一致；在属水平上，其优势菌属主要为：枝孢属（Cladosporium），桑帕氏酵母菌属（Sampaiozyma）、尾孢菌属（Cercospora）、链格孢属（Alternaria）。枝孢属（Cladosporium）是一种致腐真菌，能快速生长，诱发腐烂病[23]，链格孢属（Alternaria）能通过破坏植物的细胞壁、信号转导途径等方式引发烟草赤星病[24]，尾孢菌属（Cercospora）也是一种病原菌属，能导致烟草蛙眼病，该病在烟区为普遍发生。无论是在门水平还是属水平上，相同基因型的样本在不同生态环境的表现差异较大，这可能是受生态环境的影响造成的。

叶际定殖着大量细菌、真菌、和少量放线菌，具有固氮、抗病、促生长等多种生态功能，与植物有着非常紧密的关系[9]。本研究发现成熟期雪茄烟叶叶际真菌群落多样性Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数儋州光村（GC.）整体高于五指山（WZS.），说明生态环境与雪茄烟叶叶际真菌群落结构有着明显的相关性。研究还发现枝孢属（Cladosporium）、桑帕氏酵母菌属（Sampaiozyma）、赤霉属（Gibberella）和假尾孢属（Pseudocercospora）受生态环境的影响达极显著水平（P<0.01）。说明雪茄烟叶真菌群落结构与生态环境的相关性较之与基因型的相关性更加明显，PCoA和方差分析表明生态环境对叶际真菌群落影响高于基因型。

叶际微生物群落结构的影响因素是多方面的。既受宏观如降水、太阳辐射、昼夜温差等气候特征的影响，也受微观尺度如植物叶位、叶脉、角质层厚度及化学成分、叶面附属物及类型等的影响[21-23]，如Botella等研究表明水分、太阳辐射是地中海松（Pinus halepensis）叶际真菌的主要影响因子[24]。这是因为植物叶面的微环境相对恶劣，养分相对匮乏，叶际微生物本就难以定殖，降雨量的增加加剧了对叶际微生物的冲刷，太阳辐射增强会导致叶片温度升高和紫外线增加，都不利于叶际微生物的定殖[25]。本研究发现光村生态区的烟叶样本真菌OTU数量是五指山的3.07倍，而光村大田生育期的降雨总量为89 mm，五指山大田生育期的降雨总量达132 mm，大田生育期间五指山的降雨总量和平均光合有效辐射均高于儋州光村，雨水的冲刷和紫外线的照射都会使叶面微生物减少，由此分析降雨量和平均光合有效辐射可能是真菌结构差异的重要原因，这与Botella等人的研究结果相一致。土壤环境、温度、湿度等因素都能对微生物的群落结构造成影响[30]，本研究发现雪茄烟叶叶际优势真菌子囊菌门和担子菌门，这两类真菌在土壤中也大量存在，土壤微生物能迁移至叶际[31]，由此推断五指山样本的子囊菌门均高于光村可能是因为五指山土壤中子囊菌门数量远高于光村。

基因型也是叶际微生物菌群结构的重要影响因素，部分叶际真菌对植物种类有定殖特异性[32-33]。Baffi等研究表明橄榄叶际真菌主要包括曲霉菌属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和根毛霉菌属（Rhizomucor）等7属。高旭晖等研究表明茶树叶际真菌主要是链格孢属 （Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、尾孢属（Cercospora）等真菌[34]。不同基因型的植株通过介导叶片结构如气孔导度、叶片厚度，化学成分，分泌物而影响叶际微生物菌群结构[35-36]。如研究表明不同基因型烤烟的叶片结构、化学成分、挥发性香气物质以及腺毛主要分泌物都有显著差异[13,37]。本研究表明枝孢属（Cladosporium）受基因型影响达到显著水平（P<0.05）。

本文对雪茄烟叶成熟期的真菌群落结构与基因型和生态环境的关系进行了详细的阐述，下一步将对真菌对雪茄烟叶晾制以及发酵的影响进行研究，并结合雪茄烟叶感官品质进行分析，以探索雪茄烟叶品质形成机理。

4 结论

本研究采用高通量测序技术研究了不同生态环境和不同基因型对大田成熟期雪茄烟叶叶际真菌群落结构的影响。研究表明：（1）儋州光村雪茄烟叶叶际真菌群落的多样性高于五指山；（2）三种不同基因型的雪茄烟叶优势门主要包括子囊菌门、担子菌门、被孢霉门、毛霉门、壶菌门、罗兹菌门、球囊菌门、捕虫霉门、油壶菌门和梳霉门，优势属主要包括枝孢属，桑帕氏酵母菌属、尾孢菌属、链格孢属、被孢霉属、红菇属、黑团孢属、子囊菌属、赤霉属和假尾孢属；（3）生态环境、基因型以及二者的交互作用均能对雪茄烟叶叶际真菌群落结构造成影响，但生态环境对其影响最大。