烟草白粉病抗性连锁分子标记开发及育种利用

张孝廉，张吉顺*，贾蒙骜，张莉莉，曹领改

1 贵州省烟草科学研究院，烟草行业分子遗传重点实验室，贵阳市观山湖区龙滩坝路29号 550081；

2 贵州大学生命科学学院，贵州省农业生物工程重点实验室，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025

烟草白粉病俗称“上灰”、“下霜”、“上硝”，感病烟叶烘烤后薄如纸，色暗锈褐色，丧失经济价值，散叶堆放和鲜烟装炕阶段白粉病菌均可侵染烟叶[1]。目前，烟草白粉病的防治主要以化学防治为主，极易造成农药残留，是当前烟叶农残超标的主要因素之一。培育抗病品种是防治烟草白粉病最经济、安全和有效的方法，因此，白粉病抗性相关研究得到了广泛的关注，并取得了重要进展。小麦中已经发现了50 多个Pm（Powdery mildew）抗性位点[2-5]，拟南芥中也分离到许多涉及不同途径的白粉病抗性基因[6-8]。其中，mlo（Mildew resistance locus O）基因最先在大麦中[9]被鉴定，由于mlo介导的白粉病抗性具有广谱、持久的优点，在小麦等作物中开展了广泛的研究和利用，并取得显著效果。在番茄[10]，辣椒[11]，烟草[12]等茄科植物中也陆续报道了与白粉病抗性相关的MLO同源基因。通过对茄科植物中白粉病相关MLO基因鉴定和功能验证，明确了烟草NtMLO1基因可以互补番茄mlo突变体的感病性[12]。NtMLO1和NtMLO2基因突变导致了日本晾晒烟品种Kokubu 的白粉病抗性[13-14]。

烟草白粉病抗病育种中最广泛而成功利用的是Kokubu 抗性，而国内品种抗烟草白粉病育种也取得了一定的进展，孟坤等[15]用不同的白粉病菌对21 个烟草品种进行接种鉴定，发现对两个菌种均表现免疫的是塘蓬，表现高抗的为NC89，高感品种为中烟90 和CF203。李华丽等[16]以台烟7 号和白肋21 作为杂交亲本，后代自交衍生的127 个F2 和F2:3 家系为材料，检测到1 个烟草白粉病加性QTL，贡献率为11.63%。牟建英等[17]利用2317 对SSR 引物对烟草白粉病抗性基因进行QTL 定位，检测到1 个白粉病抗性位点，与SSR 引物52725 紧密连锁，遗传距离为1.01cM，其加性效应为-14.38，贡献率为21.02%。

本文通过对抗感分离群体进行白粉病抗病鉴定，开发与白粉病抗性紧密连锁的分子标记，旨在为国内烟草白粉病抗源的高效利用及抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料种植和接种鉴定

本研究中使用的烟草材料见表1，由贵州省烟草科学研究院种质资源库保存。统一采用漂浮育苗法育苗，置于光照培养箱中，设置8 h/16 h 光照/黑暗，25℃/23℃，80%湿度。于6 ～8 叶期进行白粉病接种实验，取新鲜的感白粉病烟草叶片，将叶片上新鲜的白粉病孢子均匀抖落在待接种烟苗上，每个材料接种烟苗30 株，置于黑暗中暗培养2 d 后恢复8 h/16 h光照/黑暗光周期，25℃/23℃，80%湿度，接种后10 d 调查发病情况。按照国家标准《GB/T 23222—2008 烟草病虫害分级及调查方法》中对白粉病发病等级的划分，鉴定烟草材料对白粉病的抗性。

表1 供试烟草品种Tab. 1 Tobacco germplasm resource used in this research

1.2 DNA 提取与NtMLO 基因突变区的克隆

根据已报道NtMLO1和NtMLO2的基因序列[14]设计引物MLO1-F/MLO1-R，MLO2-F/MLO2-R（表2）扩增突变区序列。以表1 中材料的DNA 为模板进行PCR 扩增，扩增产物进行胶回收送到上海生工公司进行基因测序。

1.3 分子标记设计与筛选

根据抗病和感病材料间NtMLO1和NtMLO2的基因序列差异，在差异位点设计引物（表2）。PCR 反应体系（20 µL）：50 ng/µL DNA 模板1 µL，2×Go Taq Mix 10 µL，100 µmol/L 正 反 向 引 物 各1 µL，ddH2O 7 µL。PCR 反应程序：94 ℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表2 引物序列信息Tab. 2 The sequence information of primers

2 结果分析

2.1 不同资源的抗性鉴定

选取8 份材料进行抗性鉴定，按照国标进行调查和统计，发现台烟7 号和KE1 表现出高抗白粉病，抗病等级为1 级，NC82 等材料表现为高感白粉病。

表3 不同烟草品种对白粉病抗性统计Tab. 3 The powdery mildew resistance of different tobacco varieties

图1 不同烟草品种对白粉病抗性的鉴定Fig. 1 Identification of powdery mildew resistance for different tobacco varieties

2.2 分离群体抗性鉴定及遗传分析

对抗病材料台烟7 号和感病材料K326 构建的960 个F2 单株及642 个BC1F1 单株开展了苗期白粉病抗性鉴定，结果表明（表4）F1 全部表现为感病，F2 群体的感抗分离比符合15:1，BC1F1 群体的抗感分离比为1:3，表明台烟7 号的抗性符合双基因隐性遗传规律。

表4 分离群体抗病/感病表型调查Tab. 4 Investigation of resistacne/susceptibility phenotype in the segregation population

2.3 不同抗性材料中NtMLO 基因克隆及标记开发

以8 份供试材料的DNA 为模板进行PCR 扩增，结果在不同材料中都扩增到了预期大小的片段，测序结果如图2 所示，感病材料中NtMLO1和NtMLO2基因的序列与参考序列相同，而台烟7 号、KE1 中的NtMLO1基因序列在2962 ～2963 bp 存在2 个碱基的差异，从AG 突变为TA，NtMLO2基因序列缺失了第2969 ～2970 位的2 个碱基。

图2 8 份供试材料中NtMLO1 和NtMLO2 基因的差异Fig. 2 The sequence differences of NtMLO1 and NtMLO2 in eight tested materials

利用抗、感材料中的基因序列差异，开发分子标记，标记序列见表2，将差异位点设计到引物的3’端，同时引入1 个碱基差异，检测不同碱基替换对扩增效率和特异性的影响。MLO1-R 与A-F 配对扩增野生型材料中的NtMLO1基因，MLO1-R 与a-F 配对扩增突变型材料中的Ntmlo1基因，MLO2-R 与B-F 配对扩增野生型材料中的NtMLO2基因，MLO2-R 与b-F 配对扩增突变型材料中的Ntmlo2基因。结果如图3所示，A-F5 和A-F7 均能特异的扩增出野生型中的NtMLO1基因，而在突变型材料中无扩增。a-F 的7 个引物都可以特异的扩增出突变型材料中的Ntmlo1基因，而在野生型材料中无扩增，但是a-F4 和a-F5 的扩增效果不好。因此选用引物对A-F7/MLO1-R 和a-F7/MLO1-R 作为NtMLO1/Ntmlo1基因的分子标记。B-F和b-F 的引物扩增效率和特异性都很好，选择B-F1/MLO2-R 和b-F1/MLO2-R 作 为NtMLO2/Ntmlo2基 因的分子标记。

图3 NtMLO 基因分子标记的筛选Fig. 3 Screening of NtMLO molecular markers

2.4 分子标记在分离群体中的应用

使用抗病材料台烟7 号和感病材料K326 构建分离群体，在F2 代群体中验证分子标记与抗性的关系。设置NtMLO1在感病品种中的基因型为A，在抗病品种中的基因型为a，NtMLO2在感病品种中的基因型为B，在抗病品种中的基因型为b。接种鉴定的结果发现只有基因型为aabb 的后代表现为抗病，而基因型为AABB、AABb、AAbb、AaBB、AaBb、Aabb、aaBB、aaBb 的单株均表现为感病。利用这四对分子标记可以明确分离后代的基因型，在杂交育种过程中可以根据基因型来选择后代单株（图4）。

图4 分子标记在F2 分离群体中的应用Fig. 4 Application of molecular markers in the F2 segregation population

2.5 分子标记在回交改良中的应用

在回交改良的过程中，如果是隐性基因控制的性状，每一代需要通过自交，鉴定后代的表型（图5a）。利用本研究开发的两个抗病分子标记（a 和b）对回交后代的基因型进行鉴定，不需要通过自交鉴定表型，即可筛选到携带抗性位点（a和b）的后代单株（图5b）。

图5 分子标记辅助回交改良与传统回交改良进程比较Fig. 5 Comparison of molecular marker assisted backcross improvement process and traditional backcross improvement process

以回交改良K326 的BC3F1 代为例，其后代存在AABB、AABb、AaBB、AaBb 四种基因型，通过a-F7/MLO1-R 和b-F1/MLO2-R 分子标记，对后代基因型进行鉴定（图6），选择两对引物均有扩增，即同时携带a 和b 抗性位点（基因型为AaBb）的单株BC3F1-5、7、9 进行套袋收种。

图6 分子标记在早代回交改良中的应用Fig. 6 Application of molecular markers in the early backcross improvement process

高代回交材料开展自交后，开展抗性纯合位点筛选结合遗传背景鉴定，可获得背景回复率高且携带抗性位点的纯合株系。为获得尽可能多的抗性单株供遗传背景鉴定，需进行较大规模的单株标记鉴定，此时，采用逐步淘汰法可显著减轻工作量。以BC6F2 为例，先使用A-F7/MLO1-R 标记进行筛选（图7A），去除掉携带A 的单株（约占3/4），使用B-F1/MLO2-R标记进行筛选（图7B），去除掉携带B 的单株（约占3/4），筛选出来的单株BC6F1-4 和27，使用a-F7/MLO1-R 和b-F1/MLO2-R 标记进行验证（图7C），BC6F2-4 和27 两个单株均有扩增，基因型为aabb。

图7 分子标记在回交改良纯合世代中的应用Fig. 7 Application of molecular markers in the last backcross improvement process

3 讨论

烟草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearumDC.）引起的严重病害，该病对烟草危害很大，发病严重时，白粉覆盖叶片，使烟叶丧失经济价值。烟草白粉病在我国各主要产烟省（自治区）均有发生，而且近年来发生严重和区域扩大的趋势，已经由烟草生产上的次要病害发展成为影响烟草生产的主要病害之一。因此开展烟草白粉病相关基因的研究及抗白粉病材料的创制对于该病的控制和提高烟叶质量具有重要意义。

研究发现，MLO基因的突变会使植物获得广谱持久的白粉病抗性[18]，创制和利用MLO基因的突变来改良植物的白粉病抗性具有重要价值。目前，在大麦[9]、小麦[19-20]、番茄[10]、茄子[21]、苹果[22]等植物中，都获得了MLO基因自然突变、诱变或基因编辑的抗白粉病材料。烟草中NtMLO1和NtMLO2两个感病基因在白粉病抗性中发挥了重要作用[12,14]，本文通过对8 份烟草资源进行了白粉病接种和抗性鉴定，获得了台烟7 号和KE1 两份抗病材料，进一步分析发现2份材料的白粉病抗性也是由于NtMLO1和NtMLO2基因同时发生了突变而获得的。

开展白粉病抗源材料的高效利用和抗性转移对烟草白粉病抗性育种具有重要价值，但由于栽培烟草是异源四倍体，NtMLO1和NtMLO2存在基因功能冗余的现象[14]，必须同时导入这两个突变位点才能使烟草获得白粉病抗性。通过常规育种手段开展白粉病抗性遗传改良，存在抗性鉴定困难、抗性易丢失、育种周期长等问题，开发白粉病抗性连锁分子标记开展白粉病辅助选择是提高育种效率的重要手段。本研究利用抗、感材料中NtMLO基因的序列差异开发分子标记，利用开发的分子标记开展了主栽品种的抗性回交改良，获得了白粉病抗性显著提高的新品系。

本文开发的分子标记在烟草苗期即可确定杂交后代的抗感情况，有效解决了烟草白粉病抗性鉴定易受环境影响，抗性易丢失等问题，在烟草白粉病抗病育种中具有重要作用。该分子标记具备以下特点：（1）成本较低，只需进行普通PCR 扩增结合琼脂糖凝胶电泳，在短时间内即可确定抗性位点的基因型。（2）4 对分子标记配合使用具有共显性特点，可有效区分杂交后代的杂合/纯合基因型。（3）品种定向改良过程中，只需利用本文的a 和b 两个分子标记可以在回交过程中对携带双突变基因型的后代单株进行筛选，无需自交一代，无需接种鉴定，可缩短约一倍育种进程，大规模单株筛选采用逐步淘汰法可显著减少标记鉴定的工作量。

4 结论

获得了烟草白粉病抗源材料2 份，其中台烟7 号的白粉病抗性符合双基因隐性遗传规律，开发了与白粉病抗性共分离的分子标记，并应用于主栽品种的抗性回交改良，可显著提高烟草白粉病抗病育种效率。