甘肃省5 种昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的致病力测定

杨淋凯，朱小芳，钱秀娟，刘卫红，姜红霞，刘长仲

（1. 甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃省植保植检站，甘肃 兰州 730020）

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)属鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属[1-3]，是一种原发生于美洲热带和亚热带地区的多食性及迁飞性农业害虫，因其生存能力强，扩展速度快，目前已侵入非洲和亚洲多个国家和地区[4]。我国于2019 年1 月在云南首次发现草地贪夜蛾，此后迅速蔓延至多个省份。甘肃省于2019年7 月2 日首次发现草地贪夜蛾，截止2019 年年底已在甘肃东部28 个县区发生，为害玉米(Zea mays)约266.67 hm2[5-6]。有研究证明入侵我国的草地贪夜蛾均为“玉米型”[7]，主要危害玉米，其次是高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)、小麦(Triticum aestivum)、甘蔗(Saccharum officinarum)等15 种作物，甚至也能在皇竹草(Pennisetum sinese)、马唐(Digitaria sanguinalis)、牛筋草(Eleusine indica)、苏丹草(Sorghum sudanense)等禾本科草类植物上生存[8]。玉米是我国主要的粮食和饲料作物，而高粱的营养成分类似于玉米，且成本更低，经加工可做成优良的饲料，减缓草地畜牧业饲草供应紧缺的压力[9]。玉米和高粱是草地贪夜蛾的主要寄主，其大规模危害会造成玉米和高粱的严重减产，这无疑对粮食安全生产和草地畜牧业发展构成了极大威胁。目前国内对该害虫的防治以几种杀虫活性强的新型化学杀虫剂为主，如甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯虫苯甲酰胺、乙基多杀菌素及相关的复合制剂，并在生产上取得了一定的防治效果[10-12]，但长期大量施用化学农药不仅污染环境、害虫容易产生抗药性，同时还增加了饲料农药超标和畜产品品质下降的风险。在生物防治方面，草地贪夜蛾也已经对转Bt 毒蛋白基因的作物及Bt 杀虫制剂产生抗性[13]，因此寻求新的生防制剂具有重要的意义。

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes, EPN)包括斯氏属(Steinernema)和异小杆属(Heterorhabditis)两类[14]，具有寄主范围广及主动搜寻能力、对环境无污染、对人畜安全、易培养、成本低、可与农药混配施用等优点[15]。作为重要的生防资源，昆虫病原线虫已被用于防治蛴螬(Scarabacidae)、韭蛆(Bradysia odoriphaga)、小地老虎(Agrotis ypsilon)等多种农林、草地、花卉以及卫生害虫[16-17]。使用昆虫病原线虫防控草地贪夜蛾已成为国内外的研究热点。昆虫病原线虫对寄主昆虫有很强的专化性，不同种类甚至品系对相同寄主的致病力不同[18]，因此正确选择适宜种类及品系是防治成功的重要因素。

甘肃气候干燥，少雨且昼夜温差大，外地引进的昆虫病原线虫难以适应当地的环境，而土著昆虫病原线虫早已适应当地的条件。因此，应用土著昆虫病原线虫具有短时间内完成定殖、建立稳定种群、更好地发挥持续高效控害等特点。为探索甘肃省昆虫病原线虫资源对防控草地贪夜蛾的潜力，拓展其在害虫生物防治中的应用，本研究利用从甘肃省采集分离获得的5 种10 个昆虫病原线虫品系，通过室内生物测定，筛选出对草地贪夜蛾具有高效生防潜力的昆虫病原线虫品系，为有效利用甘肃省昆虫病原线虫资源防治草地贪夜蛾提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫：草地贪夜蛾采自甘肃省白银市靖远县，在甘肃农业大学昆虫生态实验室饲养。

供试线虫：夜蛾斯氏线虫(Steinernema feltiae)0639C、0657YM、0661YM、0663PG、0663TD、0619HT品系，斯氏线虫(Steinernema karil) 0663YC 品系，卡森斯氏线虫(Steinernema krussei) 0657L 品系，短尾异小杆线虫(Heterorhabditis brevicaudis) 0641TY 品系，大异小杆线虫(Heterorhabditis megidis) 0627M 品系。线虫10 个品系均采自甘肃省内西峰市、天水市、武威市民勤县、白银市靖远县和景泰县等具有代表性的市县[18]，采用大蜡螟(Galleria mellonella)诱集法分离并收集线虫[19]，经品系鉴定后保存于甘肃农业大学昆虫生态实验室。定期以韭蛆(Bradysia odoriphaga)为寄主于无菌土壤中复壮以保证品系活力。试验所用线虫悬浮液为新鲜培养，由大蜡螟活体扩繁而得，保存于4 ℃冰箱内待用。

1.2 致病力测定

以草地贪夜蛾2 龄幼虫作为供试昆虫，筛选出致病力较高的昆虫病原线虫种类和品系，用致病力较高的昆虫病原线虫侵染草地贪夜蛾，并测定其对草地贪夜蛾的致病力。

1.2.1 甘肃省昆虫病原线虫种类(品系)筛选

在24 孔细胞培养板中处理，每个孔加入1 头草地贪夜蛾2 龄幼虫并用脱脂棉和滤纸进行保湿，12 个孔为一个处理，用移液枪吸取200 头线虫侵染的溶液滴加在每个孔内，1 个品系线虫为1 个处理，共10 个线虫处理，同时以等量无菌水作对照，每处理重复3 次，孔板内放置足量的草地贪夜蛾人工饲料[20]。然后将24 孔板放回人工气候箱，每隔12 h 检查草地贪夜蛾的死亡情况并记录。控制条件为温度24～26 ℃，相对湿度70%，光照 ∶ 黑暗16 h ∶ 8 h。

1.2.2 高效昆虫病原线虫品系对草地贪夜蛾2 龄幼虫的致病力测定

对筛选出的高效品系进行致病力测定，在24 孔细胞培养板中处理，每个孔加入1 头草地贪夜蛾2 龄幼虫并用脱脂棉和滤纸保湿，12 个孔为一个处理。每种线虫设6 个数量梯度，使线虫与草地贪夜蛾2 龄幼虫数量比分别为5 ∶ 1、10 ∶ 1、20 ∶ 1、40 ∶ 1、80 ∶ 1、160 ∶ 1，同时以等量无菌水处理作对照，每处理重复3 次，孔板内放置足量的草地贪夜蛾人工饲料。然后将24 孔板放回人工气候箱，每隔12 h 检查草地贪夜蛾的死亡情况并记录。控制条件为温度24～26 ℃，相对湿度70%，光照 ∶ 黑暗16 h ∶ 8 h。

1.2.3 高效昆虫病原线虫品系对草地贪夜蛾预蛹的致病力测定

在9 cm 的培养皿中垫2 层滤纸，加入适量蒸馏水保持湿润，每皿放入1 头草地贪夜蛾预蛹，设200、400、800、1 600、3 200 IJs·H−15 个线虫数量梯度，用移液枪吸取各浓度的线虫直接滴加到预蛹体壁上，每处理10 头，3 次重复，以无菌水处理作对照。然后将培养皿放回人工气候箱，检查化蛹情况并记录。

1.2.4 高效昆虫病原线虫品系对草地贪夜蛾蛹的致病力测定

在带盖的小塑料盒内装入适量蛭石并加蒸馏水保持湿润，每个盒子中埋入1 头正常化蛹的供试昆虫蛹，用移液枪滴加各梯度的线虫，使线虫与草地贪夜蛾蛹的数量比分别为800 ∶ 1、1 600 ∶ 1、3 200 ∶ 1、6 400 ∶ 1、12 800 ∶ 1，每处理10 头，3 次重复，以无菌水处理作对照，操作完成后放回人工气候箱观察羽化情况并记录。

1.3 数据分析

采用SPSS 26.0 软件对所测数据进行统计分析，用平均值 ± 标准误表示测定结果。使用 One-Sample Kolmogorov-Smirnov test 对数据进行正态分布检验。符合正态分布的使用 Lev-ene’s test 进行方差齐性检验，若齐性不存在，则对百分率数据进行反正弦转换。对本试验数据进行检验表明均符合方差齐性，直接进行单因素方差分析，并使用 LSD test 进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 甘肃省昆虫病原线虫优良种类(品系)的筛选

不同昆虫病原线虫种类间对草地贪夜蛾2 龄幼虫的致死率差异较大(表1)，夜蛾斯氏线虫对草地贪夜蛾2 龄幼虫致病力最强，卡森斯氏线虫次之。幼虫被昆虫病原线虫各品系侵染24 h 后均有一定的死亡率，其中夜蛾斯氏线虫0663PG 为63.90%，显著高于其他昆虫病原线虫种类(P< 0.05)。夜蛾斯氏线虫的0657YM、0663TD、卡森斯氏线虫0657L 和斯氏线虫(S. karil) 0663YC 的致病死亡率在31%～43%，但其间差异不显著(P> 0.05)。侵染48 h 后，各品系对寄主的致死作用均有所增加，其中夜蛾斯氏线虫 0663PG 为88.90%，与其他昆虫病原线虫种类存在显著差异(P< 0.05)。侵染72 h 后，除夜蛾斯氏线虫0619HT 和短尾异小杆线虫0641TY 外，其余所有昆虫病原线虫品系的累积死亡率均在50%以上。大异小杆线虫 0627M 和夜蛾斯氏线虫0663TD的致死率为75%和72.23%，两者间差异不显著(P>0.05)。夜蛾斯氏线虫 0663PG 和卡森斯氏线虫 0657L的致死率分别达到100%和83.30%，两者间差异不显著(P> 0.05)。可见，夜蛾斯氏线虫 0663PG 和卡森斯氏线虫0657L 为对草地贪夜蛾幼虫致病力较强的昆虫病原线虫品系。

表1 10 个昆虫病原线虫品系对草地贪夜蛾2 龄幼虫的致病力Table 1 Virulence of 10 entomopathogenic nematodes strains on 2nd instar larvae of S. frugiperda

夜蛾斯氏线虫的不同品系对草地贪夜蛾2 龄幼虫的致死率存在明显差异。在夜蛾斯氏线虫的6 个供试品系中，侵染24 h 后，0663PG 的致死率为63.90%，与其余品系之间存在显著差异(P< 0.05)。侵染72 h 后，0663PG 的累计死亡率达到100%，0663TD、0657YM、0639C、0661YM 和0619HT 分 别为75.00%、63.90%、55.57%、55.57%和30.53%。

2.2 2 种高效昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的致病力

草地贪夜蛾2 龄幼虫被侵染24 h 后，夜蛾斯氏线虫0663PG 与幼虫数量比为160 ∶ 1 和80 ∶ 1 时，其致死率均为38.90%，显著高于其他线虫浓度(P<0.05)。侵染48 h 时，数量比为160 ∶ 1 和80 ∶ 1 时死亡率分别为63.90%和52.77%，两者差异不显著(P>0.05)。侵染72 h 时，其死亡率分别达到100%和61.10%，两者间存在显著差异(P< 0.05)，也显著高于其他线虫浓度(P< 0.05) (表2)。

卡森斯氏线虫0657L 侵染24 h 后，数量比为160 ∶ 1 和80 ∶ 1 时，其致死率均为27.77%。侵染48 h后，数量比为160 ∶ 1 和80 ∶ 1 死亡率较高，分别为61.10%和50.57%；处理72 h 后其死亡率分别为80.53%和58.33%，两者间差异显著(P< 0.05) (表2)。

表2 夜蛾斯氏线虫0663PG 品系和卡森斯氏线虫0657L 品系对草地贪夜蛾 2 龄幼虫的致死作用Table 2 Steinernema feltiae 0663PG and Steinernema krussei 0657L against Spodoptera frugiperda 2nd instar larvae

2.3 夜蛾斯氏线虫0663PG 品系对草地贪夜蛾预蛹的致病力测定

5 个数量梯度处理下的预蛹2 d 后均可成功化蛹，侵染13 d 后处理组和对照组开始出现草地贪夜蛾蛹羽化，处理15 d 后，夜蛾斯氏线虫0663PG 与草地贪夜蛾预蛹数量比为1 600 ∶ 1 和3 200 ∶ 1 时，蛹的羽化率为96.67%，其余梯度处理下的羽化率均为100% (表3)。

表3 夜蛾斯氏线虫0663PG 品系对草地贪夜蛾预蛹的致病力Table 3 Steinernema feltiae 0663PG against Spodoptera frugiperda prepupa

2.4 夜蛾斯氏线虫0663PG 品系对草地贪夜蛾蛹的致病力测定

5 个数量梯度下夜蛾斯氏线虫0663PG 在侵染13 d 后对草地贪夜蛾蛹的致死作用不明显，数量比为6 400 ∶ 1 和12 800 ∶ 1 时，蛹的羽化率为93.33%。对未羽化的蛹解剖发现确有线虫寄生，但各梯度下的线虫对蛹的致死率低于10%。观察结果表明，昆虫病原线虫不适合在蛹期进行防治，且线虫对草地贪夜蛾蛹的羽化时间并没有影响(表4)。

表4 夜蛾斯氏线虫0663PG 品系对草地贪夜蛾蛹的致病力Table 4 Steinernema feltiae 0663PG against Spodoptera frugiperda pupa

3 讨论与结论

本研究发现，夜蛾斯氏线虫0663PG 品系对草地贪夜蛾的致病力较高，处理48 h 时，侵染数量比为160 ∶ 1 时，其死亡率达到63.90%。梁铭荣等[21]研究发现，小卷蛾斯氏线虫AⅡ和长尾斯氏线虫X-7品系处理36 h 时，侵染数量比为50 ∶ 1 时，对草地贪夜蛾2 龄幼虫的致死作用达到92%和80%。通过结果比对分析，夜蛾斯氏线虫0663PG 致病力低于小卷蛾斯氏线虫AⅡ和长尾斯氏线虫X-7 品系，说明不同种类及品系对同一种寄主昆虫的致病力存在差异。这可能与不同种间线虫的侵染方式有关，夜蛾斯氏线虫0663PG 属于中间型线虫[22]，而小卷蛾斯氏线虫AⅡ和长尾斯氏线虫X-7 品系属于伏击型侵染策略的线虫，草地贪夜蛾2 龄幼虫比较活跃，行动速度快，更适合伏击型线虫侵染。钱秀娟等[23]在室内测定下，夜蛾斯氏线虫0619HT 对大蜡螟的致死作用最强，处理72 h 时，侵染数量比为60 ∶ 1 时，累计死亡率为96.7%。而本研究发现，0619HT在处理72 h 时，侵染数量比为200 ∶ 1 时，累计死亡率为30.53%，与供试的其他9 个线虫品系相比致病力最低，说明同种昆虫病原线虫品系对不同的寄主昆虫致病力存在差异。昆虫病原线虫的致病力会因寄主昆虫的改变而不同，因此，昆虫病原线虫的室内筛选和致病力评价在生产应用之前很有必要。

国外对于昆虫病原线虫防控草地贪夜蛾的研究早于国内，许多研究表明昆虫病原线虫具有防治草地贪夜蛾的应用潜力。Lezama-Gutierrez 等[24]和Molina-Ochoa 等[25]调查发现，斯氏线虫是土壤中分布最广的草地贪夜蛾天然病原物。Andaló等[26]在室内条件下测定了17 个巴西本地线虫品系对草地贪夜蛾的致病力, 最终得到S. arenarium和Heterorhabditissp. RSC02 两个高效品系。本研究以甘肃本地10 个昆虫病原线虫品系进行室内筛选和致病力评测，发现夜蛾斯氏线虫0663PG 的毒力最高，当0663PG 与草地贪夜蛾数量比为80 ∶ 1 时，72 h 后草地贪夜蛾幼虫死亡率在60%以上，当侵染剂量增加到160 ∶ 1时，草地贪夜蛾的死亡率达到100%，本研究认为，夜蛾斯氏线虫0663PG 品系在草地贪夜蛾的生物防治方面有着巨大潜力，可以在后续研究中与化学药剂组合使用，弥补线虫单独使用时见效慢的缺陷[27]。基于此，寻求高效低毒的杀虫剂与夜蛾斯氏线虫0663PG 混配防治草地贪夜蛾还有待研究。

本研究在室内测定了甘肃省5 种10 个线虫品系对草地贪夜蛾2 龄幼虫的致病力，筛选出致病力较好的夜蛾斯氏线虫0663PG 和卡森斯氏线虫0657L 两个品系。在低剂量下对以上2 种线虫进行致病力测定，夜蛾斯氏线虫0663PG 与草地贪夜蛾数量比为160 ∶ 1 时，处理48 h 后致死率为63.90%，与卡森斯氏线虫0657L 的致死率相近，但处理72 h后草地贪夜蛾2 龄幼虫死亡率达到100%，同样数量比下卡森斯氏线虫0657L 对2 龄幼虫的致死率为80%，夜蛾斯氏线虫0663PG 的致病力高于卡森斯氏线虫0657L。在大剂量下用夜蛾斯氏线虫0663PG侵染草地贪夜蛾预蛹和蛹，预蛹在线虫处理下2 d后成功化蛹，预蛹和蛹分别在侵染15 d 和13 d 后完成羽化，但夜蛾斯氏线虫0663PG 对预蛹和蛹的致死率低于10%。本研究结果表明，草地贪夜蛾预蛹和蛹对昆虫病原线虫不敏感，线虫侵染后对蛹的羽化时间没有显著影响(P> 0.05)，故昆虫病原线虫并不适合在草地贪夜蛾预蛹和蛹期进行防治。