基于掺氮碳点的比率荧光法检测人体血清中的尿酸

邱 萍，黎 帆，何田爽

(南昌大学化学学院，江西 南昌 330047)

尿酸是人体中普遍存在的生物分子。由于人体中缺少催化尿酸氧化的尿酸氧化酶[1]，所以它也是嘌呤代谢的最终代谢物之一。正常生理条件下，人体血清中尿酸浓度为120～460 μmol·L-1，而在尿中为1.4～4.4 μmol·L-1[2-3]。体液里的尿酸含量维持在健康水平是极为重要的，因为尿酸的异常浓度可以引起或反映出许多疾病。比如高尿酸水平会增加心血管疾病、痛风、原发性高血压、肾脏疾病、帕金森病等疾病的风险[4-7]。并且，极低的尿酸浓度可能会导致多发性硬化症[8]。

因此，开辟一条快速、灵敏的检测尿酸的途径是具有意义重大的。到目前为止，已有多种技术用于尿酸的定量分析，如高效液相色谱[9]、荧光[10]、电化学技术[11]、紫外吸收[12]、比色法[13]、化学发光[14]、表面增强拉曼光谱[15]等。光分析法以其灵敏度高、快速和简便优点引起了人们的广泛关注。其中，比率荧光技术能得到的定量结果更为可靠[16]，不失为一个较好选择。由于比率分析法可以通过建立两组不同的信号，从而有效地使变量归一化。这可以有效地减少仪器和环境的影响，特别是在复杂的生物环境中，提高信噪比，以此来使定量更加可靠[17]。要获得双发射信号，可以通过比较探针和产物的荧光来实现。碳点是一种新兴的碳基纳米材料，具有荧光强度高、光学稳定性好、合成操作简单、毒性低、生物相容性好等优点[18]。根据文献报道，掺杂是控制纳米材料性能的优良策略[19]。胺分子作为表面钝化剂和氮掺杂源，在合成碳点过程中加入胺分子合成掺氮碳点，这种方法可以改善碳点本身的光学和电学性能。

据此，我们建立了基于氮掺杂碳点(N-CDs)的比率荧光法，利用2,3-二氨基吩嗪(DAP，产物)与碳点(探针)的荧光强度比(I580/I427)检测尿酸。在传感分析中，碘化物较为常见，价格低廉，具有类过氧化物酶活性[20,21]，是一种理想的过氧化物酶模拟试剂。基于此，在I-存在下，由尿酸产生的H2O2催化生成羟基自由基(·OH)，进而氧化邻苯二胺(OPD)生成DAP。DAP利用内滤光效应(IFE)猝灭了N-CDs在427 nm处的荧光发射，并在580 nm处产生新峰。我们采用DAP与N-CDs的荧光强度比(I580/I427)可实现实际样品中尿酸含量的定量分析。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

尿酸、尿酸酶、尿素、葡萄糖、肌酐、多巴胺和谷胱甘肽购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。邻苯二胺、组氨酸和苯丙氨酸来源于上海麦克林生化科技有限公司。二亚乙基三胺来自TCI上海化工发展有限公司。所使用的化学品都是分析纯，整个实验过程中都使用超纯水。

荧光光谱由日立F-4600荧光光谱仪(日本)在330 nm的激发下获得。紫外-可见吸收光谱来自安捷伦Cary 8454紫外-可见分光光度计(美国)的记录。粒径分布由布鲁克海文粒度分析仪(美国)测得。荧光寿命曲线采用爱丁堡稳态瞬态荧光光谱仪FLS1000(英国)得到。

1.2 N-CDs的合成

N-CDs是采用水热法制备[22]。首先将1.2 g柠檬酸完全溶解在20 mL的超纯水中。0.15 mL二亚乙基三胺加入到上述混合液中，随后超声15 min。将混合完的溶液转移到50 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中,置于200 ℃烘箱里反应14 h。冷却至室温后取出，由此产生的褐黄色产品是通过透析膜透析时间超过3 d得到的。最后，通过冷冻干燥法得到粉末状的N-CDs，并在室温下保存。

1.3 尿酸检测

将50 μL不同浓度的尿酸标准液和50 μL尿酸酶(100 μg·mL-1)依次加入100 μL Britton-Robinson缓冲液(pH 8.5)中。混合物在37 ℃下稳定15 min后，再依次加入200 μL OPD(25 mmol·L-1)，200 μL I-(14 μmol·L-1)，60 μL N-CDs溶液(400 μg·mL-1)和1 340 μL磷酸盐缓冲液(pH 5.5)。在45 ℃下，再恒温反应30 min。在330 nm激发下进行比率荧光分析，激发和发射模式下的狭缝宽度均为5.0 nm。

1.4 实际样品的处理

取南昌大学第四附属医院提供的血清样，4 000 r·min-1离心15 min，提取上清液，用磷酸盐缓冲液稀释5倍备用。同时，我们采用生化分析仪对该血清样进行了检测，以便进一步验证结果。在该法中，血清样品在4 000 r·min-1下离心3 min，取上清液(5.6 μL)将尿酸酶、4-氨基安替比林(4-AAP)和3-二苯胺二钠盐(MADB)混合。然后，用分析仪在660/800 nm波长下进行测定。

2 结果与讨论

2.1 N-CDs的表征

通过透射电镜对合成的N-CDs的形貌和尺寸进行了分析。从图1a中可以看出，N-CDs呈均匀的球形，在水溶液中具有良好的分散性，平均粒径大约为2.8 nm(图1b)。其中，高分辨透射电镜图显示N-CDs的晶格间距为0.21 nm。通过红外分析(图1c)对所制备的N-CDs键合方式和结构进行了表征。·OH拉伸振动在3 429 cm-1处产生了较宽的吸收带。此外，在2 900 cm-1附近的峰值归因于C-H烷基的伸缩振动。在1 681 cm-1处有明显的峰，表明N-CDs表面存在C-O键。1 581和1 425 cm-1以及1 028 cm-1处的吸收带分别对应于C-C和C-N以及C-O振动带。说明已成功合成了N-CDs。

2.2 N-CDs的光学性质

图2a为制备的N-CDs的紫外-可见吸收光谱。在277和321 nm处有两个明显的吸收峰，分别与碳sp2的π-π*跃迁和C=O带的n-π*跃迁有关。同时可以看出，N-CDs的发射峰由激发波长决定(图2b)。这种依赖激发峰的特性是由带隙中的新能级引起的。当激发波长从290增加到360 nm时，发射峰出现红移。激发波长为330 nm时，N-CDs的发射峰最强中心为430 nm。此外，它也具有良好的荧光稳定性。从图2c可以看出，在不同pH值的磷酸盐缓冲溶液(4.7～7.4)中，N-CDs的荧光强度在14 d内并没有明显下降。因此，合成的N-CDs是可以用于接下来的实验。

Diameter/nm

λ/cm-1图1 N-CDs的TEM(a);粒径分布图(b);红外表征图(c)

λ/nm

λ/nm

t/d图2 N-CDs的光学性质

2.3 检测原理

图3说明了基于I-和尿酸酶使用N-CDs作为荧光探针的方法基本原理。首先，尿酸酶催化尿酸(UA)生成H2O2。OPD在H2O2存在下可被I-催化氧化生成产物DAP。在330 nm的激发波长下，生成的DAP可以在427 nm处猝灭N-CDs体系中的荧光发射，而在580 nm(DAP所产生的荧光峰位)处发射荧光增强，导致不同UA浓度下的荧光发生变化。最后，利用DAP/N-CDs的荧光强度比(I580/I427)测定UA的浓度。

图3 比率荧光法的检测原理

为了研究OPD诱导N-CDs荧光猝灭的可能机理，进行了几种测定。如图4a所示，DAP的吸收光谱不仅在427 nm处与N-CDs的发射光谱有很大的覆盖区域，而且在330 nm处与激发光谱有重叠，这说明可能存在内滤光效应(IFE)或者Förster-resonance-energy转移(FRET)。为了探究这一机理，我们同时测量了N-CDs在没有DAP和存在DAP的情况下的荧光寿命。结果显示，荧光寿命没有明显变化(图4b)，说明N-CDs与DAP之间没有发生能量转移过程。在图4c中，DAP和N-CDs的zeta电位分别为-1.1和-2.6 mV。结果表明，DAP和N-CDs的zeta电位均为带负电，证实DAP和N-CDs之间几乎不存在静电吸引。此外，由于相同电荷之间发生静电排斥，N-CDs与DAP之间的距离往往大于10 nm。我们都知道，在FRET的情况下，荧光供体与受体之间的距离应不超过10 nm。因此，上述结果表明，DAP利用IFE猝灭了N-CDs的荧光发射。

λ/nm

t/ns

图4 OPD的氧化物猝灭N-CDs的机制

2.4 实验条件的优化

相关反应条件的优化对于提高传感器的灵敏度具有重要作用。根据前期工作，我们认为尿酸酶催化尿酸的反应最适宜条件是在pH为8.5的环境中,在35 ℃下孵育15 min[23-24]。随后我们研究了pH、温度、培养时间、I-浓度和OPD浓度对DAP/N-CDs(I580/I427)荧光强度比的影响，以分析后续实验的最佳测试条件。考察pH的影响可以发现最大强度比(I580/I427)在pH为5.5时。因此，后续优化实验采用最适pH值5.5进行。温度的影响范围为25 ℃～55 ℃时，45 ℃为理想温度。选择最佳孵育时间为45 min。将I-的浓度从0.2变化到1.6 mmol·L-1，OPD浓度从0.1变化到3 mmol·L-1，可以看到I-的浓度和OPD浓度在1.4和2.5 mmol·L-1时分别获得最大的发射强度比。

2.5 对尿酸的分析检测

为了证明所提出的生物传感器的性能，我们在上述最佳条件下探索了尿酸检测的线性范围和检测限。从图5a可以看出，随着UA浓度的增加，427 nm处的发射强度(I427)逐渐降低，而580 nm处的发射强度(I580)逐渐增强。在紫外光照射下，荧光光度明显由蓝色变为黄色(图5b)。不同UA浓度对应的荧光强度比(I580/I427)在0.5～150 μmol·L-1范围内呈线性关系。线性回归方程为I580/I427=0.001 82CUA+0.069 37，相关系数(R2)为0.992(图5a插图)，说明比值荧光法测定尿酸具有良好的线性关系。以3 σ/s(其中σ和s分别代表估计误差和线性回归斜率)方法计算出检测限(LOD)为0.06 μmol·L-1。

λ/nm

图5 尿酸的分析检测

2.6 选择性实验

2.7 实际样品的检测

采用比率荧光法对血样进行了分析检测，结果与生化分析仪检测结果进行了比较(表1)，平均相对误差为3.3%。本法测定人血清的回收率为94.6%～103.3%，相对标准偏差(RSD,n=3)小于3.6，说明该法具有较好的准确性，在实际应用上有很大的潜能。

1～13分别代表：(1) NaCl；(2) KNO3；(3) NH4Cl；(4) Urea；(5) AA；(6) Cys；(7) Cr；(8) Glu；(9) DA；(10) GSH；(11) His；(12) Phe；(13) UA。

图6 选择性实验，

表1 实际样品的检测

3 结论

综上所述，我们成功设计了一种基于N-CDs的比率荧光法测定了人体血清中尿酸含量。使用比率荧光输出信号，使尿酸水平的定量分析更加可靠。与传统酶法相比，用碘离子取代辣根过氧化物酶，大大降低了失活风险和成本。N-CDs不需要复杂的合成技术。所制备的N-CDs具有良好的光学性能和稳定性。该法检测尿酸具有超灵敏、高选择性和良好的实际应用前景。