九味牛黄胶囊中马兜铃酸A、木香烃内酯和去氢木香内酯含量测定*

杨春艳 德央 张燕飞 欧霞

（西藏藏医药大学，西藏 拉萨 850000）

九味牛黄丸成方于公元8 世纪，始载于藏医巨著《四部医典》中，称为牛黄九味方，处方由红花、巴夏嘎、木香马兜铃、体外培育牛黄、渣驯膏、波棱瓜子、獐牙菜、绿绒蒿、木香等药材组成。目前市场上均为丸剂，将以上九味，除渣驯膏、牛黄外，其余药粉碎成细粉，过筛，加入牛黄细粉，混匀，用渣驯膏加适量水泛丸，干燥而得。该药深受广大患者的欢迎，是治疗肝胆系统疾病常用藏药[1-4]。

九味牛黄丸主治由外伤引起的肝病，肝血旺盛，肝热，培根木布病[5]，是肝病的基础治疗药，在治疗各种急、慢性肝炎时，临床常配伍二十五味松石丸、七味红花殊胜丸等产品协同用药。亦可用于急、慢性胆囊炎，特别是胆汁排泄不畅而引起的胆囊炎症，临床常配伍十一味金色丸等共同使用。此外，对酒精肝和脂肪肝亦有明显的治疗和预防作用，常搭配七味铁屑丸、仁青芒觉等使用。

九味牛黄丸的服用方法为一次4～5 丸，一日三次，研碎后服用。该方法服用困难，患者依从性差，且由于丸剂剂型限制，临床起效慢。在系统分析文献及前期化学成分研究的基础上，本实验将其剂型改为胶囊剂，并对其质量标准进行初步探索。由于处方中含木香，为主药，根据文献资料显示木香烃内酯和去氢木香内酯含量常作为其质量标准是依据之一[6]，本实验采用高效液相色谱法（HPLC-DAD）测定两批九味牛黄胶囊中木香烃内酯、去氢木香内酯含量为九味牛黄胶囊质量标准制定提供依据。此外，因处方中含有木香马兜铃，相关文献中也有马兜铃酸限量的检测[6]，因此本实验通过测定马兜铃酸A 的含量以判断九味牛黄胶囊中马兜铃酸A是否在安全范围之内。

1 仪器与试药

实验室专用超纯水机Millipore（德国Merck 公司）、万分之一天平（Sartorius，德国Sartorius 公司）、安捷伦高效液相色谱仪Agilent 1260 Infinity（美国安捷伦公司）、Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) 色谱柱；电炉等。两批九味牛黄胶囊，标准品木香烃内酯（纯度99.56% HPLC，批号MUST-18101308），标准品去氢木香内酯（纯度99.20% HPLC，批号MUST-18101301），标准品马兜铃酸A（纯度98.81%HPLC，批号MUST-19031511）由成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所研制。液相用甲醇为色谱纯（Merck 公司），乙腈为色谱纯（Honeywell），水为超纯水，其余所用试剂均为国产分析纯（广东光华化学厂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 木香烃内酯、去氢木香内酯条件。色谱柱：Kromasil C18 (4.6mm×250mm,5μm)；流动相为甲醇（A）-水（B），采用梯度洗脱的方法，洗脱梯度程序为：0min～10min 10%～73%B，10min～20min 73%～78%B，20min～25min 78%～85%B，25min～30min 85%～100%B，流速为0.6mL/min；检测波长：225nm；柱温箱25℃；进样量15μL。理论塔板数按照木香烃内酯、去氢木香内酯计算应不低于9000[7-9]。

2.1.2 马兜铃酸A 条件。色谱柱：Kromasil C18 (4.6 mm×250mm,5μm)；流动相为乙腈-0.05%磷酸水（55：45），等度洗脱，流速为0.6mL/min；检测波长：225nm；柱温箱25℃；进样量15μL。理论塔板数按照马兜铃酸A计算应不低于5000[7-9]。

2.2 对照品溶液的制备

采用分析天平精密称定马兜铃酸A 标准品5.30mg，置于10mL 容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度线，摇匀，制得对照品储备液。

采用分析天平精密称定木香烃内酯标准品5.52mg，去氢木香内酯标准品5.64mg，置于10mL 容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度线，摇匀，制得对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

九味牛黄胶囊超声提取供试品制备：打开胶囊壳，倒出粉末，用分析天平精密称定药材粉末，两批药材分别为0.1655g、0.1558g，放入锥形瓶，分别加入100倍量的甲醇，浸泡0.5h 后，超声提取40min，过滤，取1mL 滤液再过0.22μm 微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

2.4 实验结果

依照已确立的方法进样，得马兜铃酸A 色谱图（图1、图2）、木香烃内酯和去氢木香内酯色谱图（图3、图4）。计算峰面积，代入线性回归方程（以峰面积（y，mAU）对进样量（x，μg）进行线性回归。回归方程分别为：马兜铃酸Ay=632.3x+53.386（n=8），R²=0.9997，线性范围0.065μg～8.333μg；木香烃内酯y=1295.9x+72.756（n=7），R²=0.9998，线性范围0.117μg～7.5μg；去氢木香内酯y=1787.9x+115.4（n=7），R²=0.9997，线性范围0.117μg～7.5μg），计算马兜铃酸A、木香烃内酯、去氢木香内酯含量，实验结果见表1、表2。

表1 两批九味牛黄胶囊马兜铃酸A含量测定结果（n=3）

表2 两批九味牛黄胶囊中木香烃内酯、去氢木香内酯含量测定结果（n=3）

图1 马兜铃酸A（RT=18.800）色谱图（225nm）

图2 九味牛黄胶囊HPLC图谱-马兜铃酸A（225nm）

图3 木香烃内酯（RT=27.829）、去氢木香内酯（RT=29.336）色谱图（225nm）

图4 九味牛黄胶囊HPLC图谱-木香烃内酯＆去氢木香内酯（225nm）

3 小结与讨论

在系统分析文献及前期化学成分研究的基础上，本实验采用高效液相色谱法（HPLC-DAD）对实验中制备的第1 批和第2 批九味牛黄胶囊进行检查，测定其中马兜铃酸A 和木香烃内酯、去氢木香内酯含量。测定结果显示在两批样品中，马兜铃酸A 和木香烃内酯含量低于仪器的检测限，去氢木香内酯含量在1 批和2批九味牛黄胶囊中分别为0.660%和0.659%.

实验结果表明九味牛黄胶囊中马兜铃酸A 含量低于检测限，安全性良好，无肾毒性。木香烃内酯含量低于检测限，原因可能是不同产地木香中木香烃内酯、去氢木香内酯含量存在差异，或者粉末状态下木香烃内酯与其他药材中某些物质发生了化学反应，具体原因有待下一步实验分析确定。去氢木香内酯含量在1 批和2 批九味牛黄胶囊中分别为0.660%和0.659%，可为九味牛黄胶囊质量标准制定提供依据。

从我国肝脏疾病的发病情况来看，随着国内各种预防措施的不断加强，病毒性肝炎的发病率将会有所下降，但由于现代社会人们生活的规律、暴饮暴食及酗酒等影响，非酒精性脂肪肝、酒精肝的发病率正逐年攀升［10-12］，而非酒精性脂肪肝、酒精肝的治疗药物主要以保肝护肝药物为主［13］。但九味牛黄丸作为保肝护肝药，由于丸剂剂型限制，且需捣碎后服用，患者依从性差，临床起效慢，不利于其推广。通过将其制成胶囊剂，不仅服用方面，提高患者的依从性，而且起效快，因此九味牛黄方剂型改造具有良好的发展前景。