西藏桦褐孔菌菌种分离鉴定及多糖高产菌株初筛*

徐爱国 白玛央宗 旦真次仁 高鹏

（1.西藏自治区高原生物研究所；2.西藏种质资源库，西藏 拉萨 850001；3.西藏自治区林芝市科学技术局，西藏 林芝 860000；4.西藏百菌农业科技有限公司，西藏 拉萨 850000）

桦褐孔菌,又名斜生纤孔菌，学名为Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、褐卧孔菌属，是一种珍稀的食药用菌。据文献资料显示，桦褐孔菌是前苏联各共和国、波兰、日本等国的民间常用药物，主要分布于北半球北纬40°～50°的方位内，俄罗斯北部、北欧、中国东北、日本北海道等地。根据文献资料显示和科研考察得知，桦褐孔菌在西藏自治区主要分布于林芝地区的米林、波密、察隅及日喀则地区的吉隆沟等地，但是资源量较小，随着人们的大量采挖贩卖，资源量更加稀少，在西藏桦褐孔菌产地原来邻近村庄的山林已经很难寻觅到桦褐孔菌子实体，若继续通过采挖野生资源的方式既不能满足人们需求，也不利于生态保护。因此，我们通过对西藏野生桦褐孔菌资源采集，对其菌种进行分离鉴定，并在相同液体发酵条件下，以其包内多糖和胞外多糖相加的总量为评价指标，初步筛选出西藏桦褐孔菌多糖高产菌株，以备以后进一步研究利用。

1 菌种的分离鉴定

1.1 菌种来源

DZCR161 是西藏自治区林芝市科学技术局旦真次仁于林芝地区采集，为便于描述在本文中编为1号，GP2018 是长期于西藏从事大型真菌在种植工作的高鹏于吉隆分离得到，为便于描述在本文中编为2号，XAG2403 由西藏种质资源库采集保存，菌种保藏编号为AF0002051XAG2403，为便于描述在本文中编为3号。

1.2 菌种分离纯化

选取干净新鲜的桦褐孔菌子实体，先用气吹吹去表面的灰尘等杂物，掰开在酒精灯火焰的无菌区域内，用手术刀切取子实体内部约麦粒大小子实体块，接种到，接入装有PDA 培养基斜面试管，要将挑取的组织尽量埋入培养基表层，每个子实体分离5 支试管并一一编号，将其置于25℃恒温培养箱中培养，观察其萌发情况和生长特性，选取无杂菌污染，菌丝生长粗壮旺盛的试管进行转接培养，连续几代后得到纯化菌种（见图1）。

图1 纯化的3株桦褐孔菌菌种

1.3 菌种鉴定

1.3.1 鉴定方法。将纯化后的菌种菌丝体为实验材料，用CTAB 法提取DNA，采用区扩增通用引物ITS4和ITS5 进行PCR 扩增，经凝胶成像系统检测后将PCR 反应产物送至测序公司进行测序。对测得的ITS区段DNA 序列运用GenBank 中的BLAST 工具软件在DNA 序列数据库中搜索同源DNA 序列并进行比较分析，根据BLAST 搜索和比较的结果，结合其形态学特征判断真菌的物种或与其近缘的物种。

1.3.2 序列BLAST 过程。以序列1 号为例：用bioedit打开1 号的序列，将1 号序列复制粘贴入NCBI 的BLAST 框中进行比对，得到BLAST 的结果，Per Ident高于99%（见图2），alignments结果显示序列比对结果与Inonotus obliquus是一致的（见图3），展开序列，进行下载，查看系统发育树的结果，可以确认BLAST 结果为Inonotus obliquus（见图4）。

图2 BLAST结果

图3 alignments结果

图4 系统发育树结果

2 多糖高产菌株筛选实验

2.1 液体培养基制作

1L培养基配方：马铃薯200g 去皮切成细条、玉米粉10g、豆粕粉10g，加入1000mL 水中煮沸30min，煮熟8 层纱布过滤，取滤液后补足1000mL，加入磷酸二氢钾3g，硫酸镁2g，葡萄糖20g，消泡剂5g，搅拌均匀，分装入500mL 三角瓶内，每瓶装入培养基月300mL，塞上棉塞，报纸包扎封口后在，高压灭菌锅内121℃，灭菌30min 后取出，冷却至25℃待用。

2.2 液体发酵

将分装好的液体培养基，在超净工作台分别接入1 号、2 号、3 号三个菌种，接种时每个三角瓶接入长满菌种的斜面培养基约0.5cm2一块，每个菌种接种5 瓶培养基，接种在磁力搅拌器上25℃搅拌培养，转速160转/分钟，10 天后检查三角瓶内菌丝球浓密、健壮、均匀、无污染后使用。

2.3 多糖提取

2.3.1 胞外多糖的提取。发酵结束后，取1L 发酵液用中速滤纸，抽虑分离菌丝体和发酵液，将发酵液旋转蒸发为原体积1/4 左右，然后加入4 倍体积的95%乙醇，充分搅拌使多糖沉淀出来，在4℃下静置过夜，用95%的乙醇反复冲洗多糖沉淀，以除去掺杂于其中的还原糖和小分子物质，得到下层沉淀在45℃干燥5h后，得到胞外粗多糖，称重记录，1 号、2 号、3 号菌种1L 发酵液中提取的胞外多糖分别为14.2g、10.8g、14.0 g。

2.3.2 胞内多糖的提取。取1L 发酵液发酵液，过滤得菌丝体60℃烘干至恒重，将菌体粉碎，加入30 倍体积的去离子水充分破碎，破碎后在80℃下浸提2 h，提取液减压浓缩至原体积的1/5，加3 倍体积的无水乙醇沉淀，静置数小时后过滤，沉淀物烘干得到桦褐孔菌胞内多糖，称重记录，1 号、2 号、3 号菌种1L 发酵液中菌丝体内提取的胞内多糖分别为8.7g、8.0g、11.5g。

2.3.3 多糖高产菌株筛选实验结果。实验数据表明，相同液体发酵条件下，以其包内多糖和胞外多糖相加的总量为评价指标，3 号菌种1L 发酵液所得多糖总量最多为25.5g；其次是1 号菌种22.9g，2 号菌种18.8g，见表1。

表1 多糖产量统计表

3 结论

通过分子鉴定来自与西藏的3 株野生桦褐孔菌1号、2号、3号菌种均为Inonotus obliquus(Fr.)Pilat。

通过对3 株菌菌株液体发酵，以相同条件下每个菌株产胞内、胞外多糖的总量作为评价指标，初步筛选出由西藏种质资源库采集保存的菌种保藏编号为AF0002051XAG2403 的菌种是西藏野生桦褐孔菌多糖高产菌株。

4 下一步研究思考

通过西藏桦褐孔菌液体发酵代谢产物和分子实体营养成分对比，进一步论证用液体发酵方法替代桦褐孔菌子实体的可能。

用分子育种技术对西藏桦褐孔菌菌株进行选育、液体发酵多糖高产工艺优化以及多糖提取工艺优化来实现桦褐孔菌多糖的高产，进而进行产品开发研究。