苗药血人参及其复方制剂对“免疫低下”模型小鼠的影响

许 欢 张永萍,2* 段 丽

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3.国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550025

血人参是豆科蝶形花亚科植物茸毛木蓝IndigoferastaclrvoidesLindl.的根，是贵州苗族常用药，在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中有收载，又名雪人参，《贵州民间方药集》中称为铁刷子，《云南中草药》中称其为红苦刺、山红花。血人参主要分布在云南、贵州、四川、广西等地，特别在贵州贵阳、安顺、黔东南等地分布较为广泛。血人参植物主要含有挥发油、黄烷醇、甾醇体类等活性化学成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝、抗癌、抑菌、抗病毒等作用[1-4]。血人参性温，味微苦涩，有补气摄血、滋阴补肾之功效，主治崩漏、跌打、风湿、肝硬化、痢疾及疳积等[5]。芪胶升白胶囊是贵州苗药制剂之一，由大枣、阿胶、血人参、淫羊藿等中药组成，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、抗病毒等作用，用于白血病、癌症、肿瘤的治疗[6]。免疫力是机体自身的防御能力，可抵御外界细菌、病毒对机体的攻击。免疫低下表现为机体功能的不足，是苗医理论中冷病的一种，而建立免疫低下模型是评价药物增强免疫作用的前提。偏最小二乘回归(Partial least-squaresregression，PLS)是一种新型的多元统计数据分析方法，主要用来解决多元回归分析中的变量多重相关性或解释变量多于样本点等实际问题，其理论研究进展非常迅速，应用不断扩展，涉及医学、药物学等领域。本研究通过监测环磷酰胺不同用药剂量和用药周期对模型小鼠体重、小鼠脏器指数、血常规等指标影响变化，采用SIMCA-P软件的偏最小二乘法回归(PLS)进行数据统计建模分析，通过PLS分析方法对免疫抑制模型进行综合评价，进而确定建立小鼠免疫抑制的最佳条件，为建立稳定的免疫力低下的动物模型提供实验依据。通过建立免疫低下模型，评价苗药血人参及其制剂芪胶升白胶囊对免疫抑制小鼠身体机能的作用，为苗药血人参的开发利用及芪胶升白胶囊新功能新用途的发现奠定一定实验基础。

1 仪器与材料

1.1 药品及试剂 血人参(批号：160211，贵州德昌祥药业有限公司)；血人参乙酸乙酯部位(实验室自制)；注射用环磷酰胺(批号：16070925，江苏恒瑞医药股份有限公司)；氯化钠注射液(批号：E116080908，贵州科伦药业有限公司)；氯化钠注射液(批号：E116020302，贵州科伦药业有限公司)；苦味酸(批号：130901，西陇化工股份有限公司)；羧甲基纤维素钠(批号：20160412，天津市福晨化学试剂厂)；芪胶升白胶囊(批号：25270051，贵州德昌祥药业有限公司)。

1.2 动物 SPF级KM小鼠，雄性，体重(18～22)g，购自重庆腾鑫实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2012-0011。室温(24±2)℃，相对湿度40%～60%，昼夜光照节律12 h∶12 h，自由饮水，饲固体饲料，适应性喂养7 d后进行试验。

1.3 仪器 AE/240型电子天平(上海梅特勒仪器有限公司)；BC-5380血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；JJ223BC电子分析天平(常熟市双杰测试仪器厂)；EDTAK2一次性使用人体静脉血样采集器(浏阳市三力医用科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 “免疫低下”动物模型的复制

2.1.1 动物分组 小鼠适应性饲喂养7 d后随机分成正常组、5个模型组(模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组)，每组8只。

2.1.2 动物造模 参照相关文献[7-11]的基础上，环磷酰胺干粉用生理盐水稀释配成10 mg/mL浓度的环磷酰胺溶液，现用现配。采用腹腔注射，正常组每日注射生理盐水，模型Ⅰ组，连续腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，共6 d；模型Ⅱ组，按照40 mg/kg的剂量隔日注射环磷酰胺溶液，首次80 mg/kg，共4次；模型Ⅲ组，连续腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，共6次；模型Ⅳ组腹腔注射100 mg/kg环磷酰胺造成免疫力低下模型，1次/d，连续6 d；模型Ⅴ组每天腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg，连续6 d，各组动物注射完成后常规饲养至10 d。

2.1.3 指标检测 造模过程中每天测量并记录各组小鼠体重，观察饮水、饮食状况。动物处死前先称体重，称量脏器(胸腺、脾脏)重量，计算脏器指数(脏器指数=脏器重量/体重)。动物处死前摘眼球取血，用EDTA-K2抗凝管抗凝，做血常规分析。

2.2 苗药血人参及其复方制剂对“免疫低下”模型小鼠的作用

2.2.1 药品的配制 环磷酰胺注射液的配制：取环磷酰胺无菌注射粉末于十万分之一天平称重，用生理盐水配成10 mg/mL，现配现用。芪胶升白胶囊溶液的配制：取芪胶升白胶囊取胶囊内容物，万分之一天平称重后，用0.25%羧甲基纤维素钠配成2.00、1.00、0.50 g/mL，4 ℃保存备用；血人参乙酸乙酯部位溶液的配制：取血人参乙酸乙酯部位加水配制成0.32、0.16、0.08 g/mL 4 ℃保存备用。

2.2.2 动物造模 参照文献[8-9]及前期实验基础上，采用造模与给药同时进行的方式，各组小鼠连续灌胃20 d，除正常组每天给生理盐水外，其余各组以100 mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺构建免疫力低下模型，1次/d，连续6 d，同时给予相应浓度的血人参乙酸乙酯部位药液和芪胶升白胶囊药液治疗。

2.2.3 分组与给药 将小鼠随机分为正常组，模型组，血人参高、中、低剂量组(剂量分别为：0.32、0.16、0.08 g/kg)、芪胶升白胶囊高、中、低剂量组(剂量分别为：2.00、1.00、0.50 g/kg)，每组10只。给药体积均为0.1 mL/10 g，连续给药20 d。

2.2.4 检测指标 第20天给药后，禁食不禁水12 h，称重后，摘眼球取血，集满1 mL左右血液后，用脱臼法处死小鼠，取胸腺、脾脏器称重，计算脏器指数。脾指数=脾重(mg)/体重(g)，胸腺指数=胸腺重(mg)/体重(g)。用血细胞分析仪测量各组小鼠白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板数量、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、血红蛋白量。

3 结果

3.1 环磷酰胺对小鼠体重的影响 由表1可见，与正常组相比，模型组小鼠的终体重都降低，除模型Ⅱ组外差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 小鼠终体重的比较

3.2 环磷酰胺对小鼠免疫器官指数的影响 从表2可见，环磷酰胺引起小鼠胸腺和脾脏变化，模型组Ⅱ小鼠的胸腺指数较正常组减小(P<0.01)；模型组脾指数增大，其中模型Ⅱ和模型Ⅲ组差异尤其明显(P<0.01)，模型Ⅳ差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 环磷酰胺对模型小鼠免疫器官指数的影响

3.3 环磷酰胺对小鼠血液学指标的影响 由表3可见，与正常组相比，模型Ⅰ组小鼠的红细胞、血红蛋白、红细胞压积、红细胞分部宽度均有不同程度的降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；模型Ⅱ组小鼠红细胞、血红蛋白、红细胞压积、红细胞分均有不同程度的降低且差异具有统计学意义(P<0.01)；模型Ⅲ组小鼠白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白浓度、血小板、平均血小板体积、血小板积压变化差异有统计学意义(P<0.01)，红细胞分部宽度升高且差异有统计学意义(P<0.05)；模型Ⅳ组小鼠白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白浓度、红细胞分部宽度、血小板、平均血小板体积、血小板积压变化差异有高度统计学意义(P<0.01)；模型Ⅴ组小鼠红细胞、红细胞分部宽度变化差异有高度统计学意义(P<0.01)，血红蛋白、红细胞压积、平均血小板体积变化差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 环磷酰胺对模型小鼠血液学指标的影响

3.4 采用偏最小二乘法 (PLS)对各组药效综合分析

3.4.1 对6个组的检测指标进行标准化处理 对本实验6个组的检测指标进行标准化处理，自变量表见表4。

表4 自变量表

3.4.2 VIP变量投影重要性指标 VIP变量投影重要性指标用来描述自变量对因变量的解释能力，VIP值越大，自变量x对y的解释能力越强。各组小鼠综合药效得分表。见表5。

表5 各组小鼠综合药效得分表

3.4.3 各组小鼠综合药效得分比较图 采用SIMCA-P软件的偏最小二乘法回归(PLS)对模型小鼠的终体重、脏器指数、血常规等指标进行数据统计建模分析，结果如图1所示，模型组较正常组差异均有显著性，其中模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组差异都有显著性，其中模型Ⅳ明显是较佳的造模方法。

图1 各组小鼠综合药效得分比较图

3.5 对免疫抑制小鼠体重的影响 与正常组比较，各组小鼠给药第1天，体重无明显差异，给药第3天体重下降，具有高度统计学差异(P<0.01)；与模型组相比，实验第13天，血人参乙酸乙酯部位高中低剂量组体重增加，无统计学差异(P>0.05)，说明血人参乙酸乙酯部位高、中剂量对环磷酰胺致小鼠体重下降有一定的抑制作用；实验第19天，芪胶升白胶囊2.00、1.00 g/kg剂量组体重增加，有统计学差异(P<0.05)，说明芪胶升白胶囊2.00、1.00 g/kg剂量对环磷酰胺致小鼠体重下降有一定的抑制作用。结果见表6。

表6 免疫抑制小鼠体重的比较

3.6 对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响 由表7 可知，与正常组比较，血人参乙酸乙酯部位各剂量能降低小鼠脾指数，但无统计学差异；与模型组比较，血人参乙酸乙酯部位低剂量组能升高小鼠脾指数，但无统计学差异。与正常组比较，血人参乙酸乙酯部位各剂量组使小鼠胸腺指数升高，但无统计学差异；与模型组比较，血人参乙酸乙酯部位各组均能明显升高免疫抑制小鼠胸腺指数，血人参乙酸乙酯部位高剂量组能升高小鼠脾指数，且有统计学差异(P<0.05)；血人参乙酸乙酯部位中剂量组能升高小鼠胸腺指数，具有高度统计学差异(P<0.01)。以上结果表明血人参乙酸乙酯部位高中低剂量组均可升高免疫抑制小鼠的胸腺指数，但对其脾指数影响不大。

由表7可见，与正常组比较，芪胶升白胶囊高剂量组能升高小鼠脾指数，但无统计学差异；与模型组比较，芪胶升白胶囊高、中剂量组能升高小鼠脾指数，但无统计学差异。与正常组比较，芪胶升白胶囊各剂量组均能升高小鼠的胸腺指数；与模型组比较，芪胶升白胶囊各组均能明显升高免疫抑制小鼠胸腺指数，但无统计学差异。以上结果表明芪胶升白胶囊高、中、低剂量组可明显升高免疫抑制小鼠的胸腺指数，但对其脾指数影响不大。

表7 小鼠脾指数、胸腺指数的比较

3.7 对免疫抑制小鼠血常规的影响 由表8 可知，与正常组比较，实验各组的白细胞数量减少，且具有高度统计学差异(P<0.01)，红细胞数量、血红蛋白量均减少，但无统计学差异；血人参乙酸乙酯部位高剂量组血小板数量增加，有高度统计学差异(P<0.05)，血人参中剂量组血小板数量增加，有高度统计学差异(P<0.01)，说明用环磷酰胺致白细胞减少型免疫抑制型模型成功，可以用来评价药物升高白细胞增强免疫的动物模型。与模型组相比，血人参乙酸乙酯部位高、中剂量组的白细胞、红细胞数、血红蛋白数量稍有升高，但无统计学差异；血人参乙酸乙酯部位各剂量组小鼠的血小板数量均升高，有统计学差异(P<0.01)；血人参低剂量组的白细胞、红细胞数、血红蛋白数量降低，但无统计学差异，说明血人参乙酸乙酯部位对环磷酰胺致小鼠免疫抑制有一定抑制作用。

由表8可知，与正常组比较，环磷酰胺组的白细胞数量减少，且具有高度统计学差异(P<0.01)，红细胞数量、血小板数量、血红蛋白量均减少，但无统计学差异，说明用环磷酰胺致白细胞减少型免疫抑制型模型成功，可以用来评价药物升高白细胞增强免疫的动物模型。与模型组相比，芪胶升白胶囊高、低剂量组的白细胞、红细胞数、血小板数、血红蛋白数量稍有升高，但无统计学差异；芪胶升白胶囊中剂量组的白细胞、血小板数量升高，但无统计学差异，说明芪胶升白胶囊对环磷酰胺致小鼠免疫抑制有一定抑制作用。

表8 小鼠血常规的比较

4 讨论

免疫低下是指机体免疫系统由于先天性发育不良或后天遭受损害所致的免疫功能降低或缺乏[12]，机体免疫低下时，易于感染或发生免疫性疾病等免疫功能异常的表现[13]。环磷酰胺，为烷化剂类抗肿瘤药，科研试验中也采用环磷酰胺构建免疫低下模型[14-17]、免疫抑制模型[18]等。环磷酰胺为免疫抑制剂，恶性肿瘤患者服用该药后出现的一系列不良反应，如少气懒言、神疲倦乏、乏力自汗、心悸失眠、记忆减退、腰膝酸软、恶心呕吐等症状，皆属于免疫功能降低的表现。血液中的各种白细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血浆中的各种抗体和补体时机体免疫细胞和免疫分子中的成分，在机体的免疫防御系统中起着重要作用。红细胞也与机体免疫反应有关，红细胞表面有补体受体，能黏附免疫复合物，将其带到肝和脾脏使免疫复合物被巨噬细胞吞噬，从而能清除病理性循环免疫复合物。因此，本实验通过检测小鼠血常规中的白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白的数量来评价血人参对环磷酰胺致小鼠免疫功能降低的抑制作用。

芪胶升白胶囊是根据少数民族苗族民间验方，选用名贵地道药材，运用现代科学方法，提炼精制而成的纯中药制剂，芪胶升白胶囊具有益气生血、补血益髓、温补肾阳的作用[19-20]。实验结果显示，非特异性免疫方面：芪胶升白胶囊能明显升高免疫抑制小鼠胸腺指数，提示其增强正常小鼠机体免疫功能可能与免疫器官无直接联系，但芪胶升白胶囊增强免疫抑制小鼠免疫功能可能与胸腺有密切联系，为芪胶升白胶囊有待发展成为免疫调节的辅助用药提供理论参考，同时也为临床推广应用提供一定的实验依据。芪胶升白胶囊是贵州民间传统苗药验方中成药产品，其增强机体免疫功能的作用是单一成分起作用还是多种成分起作用，有待进一步研究。芪胶升白胶囊具有升高白细胞、提高免疫抑制小鼠胸腺指数的作用，可以为其临床应用提供实验基础，增强了该药在临床应用的安全性、合理性和科学性。芪胶升白胶囊处方的重要组成成分血人参具有滋阴补虚、调经摄血、活血舒筋的功效，研究发现其乙酸乙酯部位具有增加血小板数量、提高免疫抑制小鼠胸腺指数的作用，然而其升高机体血小板数量的作用是单一成分起作用还是多种成分起作用，有待进一步研究。