龙胆泻肝丸（浓缩丸）现行质控标准的提高研究

李占芳 李俊卿 宋建建 巴小翠 李 媛 许 伟

山东省东营市食品药品检验中心，山东东营257091

龙胆泻肝丸（浓缩丸）由龙胆、柴胡、黄芩、栀子（炒）、泽泻、木通、车前子（盐炒）、当归（酒炒）、地黄、甘草（蜜炙）10味药材组成，具有清肝胆、利湿热的作用[1]。临床上主要用于肝胆湿热，头晕目赤，耳鸣耳聋，耳肿疼痛，胁痛口苦，尿赤涩痛，湿热带下的治疗[2]。中药成方制剂的临床疗效是各成分的共同作用，龙胆为君药，可以清下焦湿热、清肝胆实火；栀子、黄芩为臣药，助龙胆清泻肝火；泽泻、木通和车前子清下焦湿热；地黄、当归补阴血；柴胡疏肝；甘草调和诸药。龙胆泻肝丸（浓缩丸）现行质量标准中，主要检测项目为显微鉴别和薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）鉴别[1]，而对其他药材的鉴别和含量测定均未作规定，质量标准较为简单。为了进一步有效控制该制剂的质量水平，本研究对现行质量标准进行提高和完善，主要针对各药材的薄层色谱鉴别和含量测定进行研究，增加当归、甘草的薄层色谱鉴别，建立龙胆、黄芩、栀子3味药材中龙胆苦苷、黄芩苷和栀子苷的含量测定。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）（日本岛津制作所，出厂编号：L20154970517US）；梅特勒XS205DU电子分析天平（瑞士梅特勒，出厂编号：1128491122）。

1.1.2 试剂及药材 样品：龙胆泻肝丸（浓缩丸）（A 公司批号分别为 0041001、0041002、9041002；B 公司批号分别为 200307、200404、200401）；对照药材和对照品：当归（中国食品药品检定研究院，120927-201516）、甘草（中国食品药品检定研究院，120904-201511）、龙胆苦苷（中国食品药品检定研究院，110720-201918）、黄芩苷（中国食品药品检定研究院，110715-201821）、栀子苷（中国食品药品检定研究院，110749-201919）；试剂与耗材：甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191224）、乙腈（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200303）均为色谱纯；硅胶G薄层板（德国默克薄层层析板）；磷酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：20181025）为优级纯，其他试剂为分析纯，水为实验室自制纯化水。

1.2 方法

1.2.1 当归的薄层色谱鉴别方法 取本品适量，研细，称取约0.5 g，加甲醇30 ml，加热回流30 min，过滤，滤液蒸干，用20 ml水溶解残渣，用石油醚（60～90℃）提取3次，每次25 ml，合并石油醚液，石油醚液蒸干（水液留存，用于甘草的薄层色谱鉴别样品溶液的制备），加乙醇0.5 ml使残渣溶解，作为样品溶液；另取当归对照药材0.5 g，同样品溶液制备方法，制成当归对照药材溶液；按龙胆泻肝丸（浓缩丸）制法[1]，制成缺当归的阴性样品，同样品溶液制备方法，制成缺当归阴性样品溶液。按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502项下操作[3]，样品溶液和缺当归阴性样品溶液的点样量均为5 μl，当归对照药材溶液点样量为2 μl，展开剂为正己烷∶乙酸乙酯（7.5∶2.5），展开于硅胶G薄层板上。在紫外光（365 nm）灯下观察。

1.2.2 甘草的薄层色谱鉴别方法 取“1.2.1”项下的水液，以乙酸乙酯为提取液，振摇提取2次，每次20 ml，弃去乙酸乙酯液，取水液，用正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，加乙醇1 ml使残渣溶解，作为样品溶液；另取甘草对照药材1.0 g，同样品溶液制备方法制成甘草对照药材溶液；按龙胆泻肝丸（浓缩丸）制法[1]，制成缺甘草的阴性样品，同样品溶液制备方法制成缺甘草阴性样品溶液；按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502项下操作[3]，样品溶液和缺甘草阴性样品溶液点样量均为5 μl，甘草对照药材溶液点样量为2 μl，展开剂为三氯甲烷∶甲醇∶水（30∶12∶3）的下层溶液，展开于硅胶G薄层板上，以5%香草醛硫酸溶液为显色剂，110℃加热，使斑点显色清晰。

1.2.3 龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量测定方法1.2.3.1 色谱条件 色谱柱：资生堂C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速 1.0 ml/min，柱温25℃，进样量10 μl，检测波长254 nm，流动相为甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），进行梯度洗脱，见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.2.3.2 混合对照品溶液的制备 精密称取适量龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 ml含龙胆苦苷80 μg、栀子苷60 μg、黄芩苷170 μg的混合对照溶液。

1.2.3.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，约取0.5 g，精密称定，置于50 ml锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，密塞，精密称定，置水浴上加热回流50 min，放至室温，用50%甲醇补足重量，过滤，续滤液作为供试品溶液。

1.2.3.4 阴性样品溶液的制备 按龙胆泻肝丸（浓缩丸）制法[1]制备缺龙胆、栀子、黄芩阴性样品，按“1.2.3.3”项下方法制成阴性样品溶液。

1.2.3.5 方法学考察

1.2.3.5.1 专属性试验 取“1.2.3.2”“1.2.3.3”“1.2.3.4”项下3种溶液各10 μl，按“1.2.3.1”项下色谱条件进行测定。

1.2.3.5.2 线性关系考察 取“1.2.3.2”项下的混合对照溶液，精密量取 2、2.5、5、7.5、10 ml分别置于10 ml量瓶中，分别加入50%甲醇，稀释至刻度，摇匀，按“1.2.3.1”项下的方法测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，进行回归分析。

1.2.3.5.3 精密度试验 精密吸取“1.2.3.2”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，计算3个成分峰面积的RSD。

1.2.3.5.4 稳定性试验 按“1.2.3.3”项下制备同一供试品溶液，分别于 0、4、8、12、16、24 h 进行测定，计算3个成分峰面积的RSD。

1.2.3.5.5 重复性试验 按“1.2.3.1”项下方法，取同一供试品，平行制备6份样品溶液，取6份样品溶液的测定结果，计算其RSD。

1.2.3.5.6 回收率试验 取同一样品（A公司，批号为0041001），平行取6份，精密称定，分别置于100 ml锥形瓶中，分别加入龙胆苦苷0.468 4 mg、栀子苷 0.3641 mg、黄芩苷 0.9754 mg，按“1.2.3.3”项下方法制备样品溶液，按“1.2.3.1”项下色谱条件进行测定。

1.2.3.5.7 含量测定 取本品样品6批，按“1.2.3.3”项下方法制备样品溶液，每批制备两份，按“1.2.3.1”项下色谱条件进行测定。

2 结果

2.1 当归的薄层色谱鉴别结果与分析

按照“1.2.1”的方法操作，在紫外光（365 nm）灯下观察，见图1。在供试品色谱中，阴性对照无干扰，供试品与对照药材色谱在相同的位置上显示相同颜色的荧光斑点。

图1 当归的薄层色谱鉴别结果

2.2 甘草的薄层色谱鉴别结果与分析

按照“1.2.2”的方法操作，110℃加热至斑点显色清晰，见图2。在供试品色谱中，阴性对照无干扰，供试品与对照药材色谱在相同的位置上显示相同颜色的斑点。

图2 甘草的薄层色谱鉴别结果

2.3 龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷含量测定的结果与分析

2.3.1 专属性试验 按照“1.2.3.5.1”项下方法测定，得混合对照品、样品和阴性对照高效液相色谱图，结果见图3～5。从各色谱图中可以看出，阴性无干扰，各成分峰型均较好，各峰均完全分离，达到分离度的要求，此条件适合用于龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量测定。

图3 混合对照色谱图

图4 样品色谱图

图5 缺龙胆、栀子和黄芩阴性样品色谱图

2.3.2 线性关系考察 按照“1.2.3.5.2”方法测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，进行回归分析，结果见表2。龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的r值均＞0.9995，说明在线性范围内，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品的质量浓度与峰面积的线性关系良好。

表2 龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷的回归方程

2.3.3 精密度试验 按照“1.2.3.5.3”方法测定，分别计算龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰面积的RSD，见表3。龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰面积的RSD均＜1%，该方法符合精密度试验要求，也说明仪器精密度符合规定要求。

2.3.4 稳定性试验 按照“1.2.3.5.4”方法测定，计算龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰面积的RSD，见表3。龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷峰面积的RSD均＜1.5%，说明处理后样品溶液中的龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷在24 h内稳定，无降解等反应发生。

2.3.5 重复性试验 按照“1.2.3.5.5”方法测定，根据6份样品的测定结果计算RSD，见表3。结果表明该方法重复性良好。

表3 龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷精密度、稳定性、重复性试验的RSD结果（%）

2.3.6 回收率试验 按照“1.2.3.5.6”方法测定，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的平均回收率分别为99.2%、98.7%、97.9%，RSD分 别 为 1.05%，0.87%，1.13%（n=6）。结果表明该方法回收率高，方法可行。

2.3.7 样品含量测定 按照“1.2.3.5.7”方法测定，计算含量，测定结果见表4。从结果可以看出，不同厂家的样品或相同厂家不同批次的样品，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量差别较大，说明药材不同批次的质量差异较大，需进行严格的质量控制。

表4 样品含量结果（mg/g）

3 讨论

3.1 薄层色谱定性鉴别

通过参考文献[4-8]，比较甲醇、乙醇、50%乙醇和乙酸乙酯等不同的提取溶剂，考察了30 min回流和60 min回流、30 min超声和60 min超声等不同的提取方法，最终确定甲醇为提取溶剂，30 min回流的提取效果最好；同时考察了不同体系的展开剂，最终确定当归的展开剂为正己烷∶乙酸乙酯（7.5∶2.5）时，甘草的展开剂为三氯甲烷∶甲醇∶水（30∶12∶3）的下层溶液时，展开效果最好。本研究同时研究了柴胡和泽泻两种药材的薄层色谱鉴别，但因这两种药材的阴性均有干扰，未找到合适的提取、展开和分离方法，未能建立柴胡和泽泻的薄层色谱鉴别方法。

3.2 色谱条件的优化

3.2.1 波长和流动相的选择 参照《中华人民共和国药典》龙胆泻肝丸水丸的质量标准[2]，考察了254、277、240 nm三个波长，254 nm波长下，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷三种成分的峰形最好、回收率高、重复性好、分离也最好，最终选择了254 nm作为三种成分的检测波长。依据相关文献方法和报道[9-20]，本文比较了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液进行梯度洗脱的效果，通过比较，发现以甲醇-0.3%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷三种成分的峰形最好、回收率高、重复性好、分离也最好。最终确定以甲醇-0.3%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱。

3.2.2 提取条件的选择 在含量测定试验中，本文对不同的提取溶剂（水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇），超声提取时间（0、30、40、60 min），回流提取时间（0、30、40、60 min）进行比较，结果表明 50% 甲醇、回流提取40 min处理供试品时提取效果最好，最终确定以50%甲醇、回流提取40 min处理供试品。

4 小结

本研究建立了龙胆泻肝丸（浓缩丸）中甘草和当归的薄层色谱鉴别方法，建立了龙胆泻肝丸（浓缩丸）中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷3种成分含量的高效液相色谱法测定方法，该方法简便、准确性好、精密度高。结果显示不同厂家的样品之间、相同厂家不同批次的样品之间，其龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量存在较大差异，特别是龙胆苦苷和黄芩苷，差异可达2～4倍，存在质量风险。建议提高该制剂浓缩丸的标准，以便更好地控制其质量。龙胆泻肝丸（浓缩丸）为复方制剂，由10味药材组成，浓缩丸中各成分提取比较困难，本研究只对其中当归、甘草、龙胆、栀子和黄芩五种药材的成分建立了质量控制，而柴胡、泽泻、木通、车前子、地黄五种成分还未能建立合理有效的质量控制的方法，需要进一步研究提高。