两种常用老年痴呆大鼠模型制备方法对比

韩 宁 刘兴林 台雪姣

1.湖北医药学院基础医学院药理学教研室，湖北十堰 442000；2.湖北医药学院实验动物中心，湖北十堰 442000；3.湖北医药学院基础医学院病理学教研室，湖北十堰 442000

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病[1]，目前对AD的治疗尚无有效方法[2]。因此，迫切需要研发出有效的AD治疗药物，而药物开发的前提是具有理想的动物模型。目前公认的AD模型有APP转基因小鼠模型、β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）动物模型、慢性铝过负荷致痴呆模型等。以上都是当前AD研究中较为常用的动物模型，但转基因模型所需成本较高。通过查阅文献发现对于Aβ动物模型和慢性铝过负荷致痴呆模型的研究，其结果差异较大尚未形成统一的结论。本研究通过比较当前常用的两种AD模型，寻找AD研究中最佳的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠65只[实验动物批号：SCXK（鄂）2019-0008]，湖北医药学院实验动物中心提供，体重（240±20）g。

1.1.2 药物及仪器 Aβ25-35（上海睿安生物科技有限公司，A4559）、大鼠脑立体定位仪（成都泰盟软件有限公司，DW-5）、WMT-100S水迷宫视频分析系统（成都泰盟软件有限公司，WM-100S）。

1.2 实验方法

1.2.1 Aβ25-35孵育方法 Aβ25-35在体内并不存在，但其神经毒性与Aβ几乎相同。研究表明Aβ的神经毒性主要集中在中段，因此可采用侧脑室注射Aβ25-35制备痴呆动物模型。在使用前将Aβ25-35溶解于无菌双蒸水中形成浓度为2 g/L的溶液，37℃孵育100 h使其成为不可溶解的纤维状[3-4]。

1.2.2 预实验 随机选取SPF级雄性SD大鼠20只分为两组，一组给予Aβ25-35侧脑室注射，另一组给予D-半乳糖和亚硝酸钠颈背部皮下注射，三氯化铝饮用。希望实验人员熟练掌握两种造模方法。

1.2.3 模型制备及给药方式 将动物随机分为三组，每组各15只。模型Ⅰ组动物用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉。颅顶部做正中矢状切口，暴露前囟。于前囟后1.5 mm，矢状缝右旁开1.5 mm处钻开颅骨，垂直进针，达脑表面下3.5 mm，缓慢给予Aβ25-35溶液3 μl，缝合皮肤。模型Ⅱ组采用D-半乳糖、亚硝酸钠及三氯化铝联合给药。将三种药物配制成水溶液，前两种按照45 mg/（kg·d）、500 mg/（kg·d）皮下注射，后者以 40 mg/（kg·d）饮用，连续1个月。正常组操作相同，药物均改为生理盐水。

1.2.4 水迷宫实验观察大鼠学习记忆能力 造模后1周开始水迷宫实验。前4 d行定位航行实验，水温25℃。将水迷宫分为四个象限，平台固定于第一象限。每只大鼠1 d接受两次训练，记录大鼠找到平台的时间。第5天行空间探索实验，撤去平台，让大鼠自由游泳60 s寻找平台。记录大鼠第一次跨越平台时间和平台所在象限停留时间。5周后再次行水迷宫实验。

1.2.5 大鼠存活率检测 记录各组大鼠在造模后48 h和40 d内的存活率。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，大鼠存活率以百分数（%）表示，采用χ2检验。计量资料以（）表示，采用方差分析。水迷宫定位航行实验、水迷宫空间探索实验结果采取方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠存活率比较

造模后48 h内，各组大鼠均无死亡。造模后40 d内，正常组大鼠死亡0只，模型Ⅰ组大鼠死亡2只，模型Ⅱ组大鼠死亡0只。三组大鼠48 h、40 d内存活率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 三组大鼠存活率比较

2.2 三组水迷宫定位航行实验结果

造模后一周，与正常组相比，模型Ⅰ组、模型Ⅱ组大鼠的第1天逃避潜伏期差异无统计学意义（P＞0.05），后3 d逃避潜伏期较长且差异有统计学意义（P＜0.05）。模型Ⅰ组、模型Ⅱ组比较，第3、4天大鼠逃避潜伏期比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。造模后5周，模型Ⅰ组与正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而模型Ⅱ组与正常组相比第1、2天差异无统计学意义（P＞0.05），但第3、4天差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表 3。

表2 三组造模后1周水迷宫定位航行实验结果（，s）

表2 三组造模后1周水迷宫定位航行实验结果（，s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型Ⅰ组比较，*P＜0.05

组别 第1天 第2天 第3天 第4天正常组 45.1±6.2 28.7±3.3 17.0±4.3 16.5±4.1模型Ⅰ组 48.4±4.7 39.1±4.6# 33.2±3.1# 27.3±3.2#模型Ⅱ组 45.5±5.9 36.1±4.9# 27.1±2.2*# 22.0±2.6*#F值 0.875 17.843 38.247 24.873 P值 0.791 0.023 0.000 0.000

表3 三组造模后5周水迷宫定位航行实验结果（，s）

表3 三组造模后5周水迷宫定位航行实验结果（，s）

注：与正常组比较，#P＜0.05

组别 第1天 第2天 第3天 第4天正常组 43.1±5.1 26.5±3.8 15.0±3.8 13.6±4.5模型Ⅰ组 44.6±4.3 28.1±4.3 17.3±4.2 15.1±3.4模型Ⅱ组 45.2±6.4 33.5±4.7 25.4±4.2# 20.7±3.3#F值 2.371 1.639 25.384 19.870 P值 0.285 0.592 0.013 0.032

2.3 三组水迷宫空间探索实验结果

造模后1周，两模型组大鼠的第一次穿越平台时间和平台所在象限停留时间与正常组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型Ⅰ组相比，模型Ⅱ组大鼠第一次穿越平台时间较短且在平台所在象限停留时间长，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。造模后5周，模型Ⅰ组大鼠的第一次穿越平台时间和平台所在象限停留时间与正常组相比差异均无统计学意义；模型Ⅱ组与正常组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表4 三组造模后1周水迷宫定位航行实验结果（，s）

表4 三组造模后1周水迷宫定位航行实验结果（，s）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型Ⅰ组比较，*P＜0.05

组别 第一次穿越平台时间 平台所在象限停留时间正常组 15.2±2.9 26.7±3.0模型Ⅰ组 29.6±3.2# 15.3±2.5#模型Ⅱ组 23.2±3.1*# 21.2±3.4*#F值 12.657 17.382 P值 0.000 0.012

表5 三组造模后5周水迷宫定位航行实验结果（，s）

表5 三组造模后5周水迷宫定位航行实验结果（，s）

注：与正常组比较，#P＜0.05

组别 第一次穿越平台时间 平台所在象限停留时间正常组 12.5±4.0 20.7±2.4模型Ⅰ组 14.6±3.2 18.6±2.3模型Ⅱ组 21.8±4.1# 15.2±3.4#F值 20.543 13.279 P值 0.034 0.000

3 讨论

AD也称为老年痴呆，随着年龄的增加其发病率逐渐增高[5-6]。中国是世界上AD患者基数最大的国家，也是人口老龄化速度最快的国家之一[7]。所以对AD的研究刻不容缓，而合理有效的动物模型是疾病实验研究的基础。大鼠比较接近灵长目动物，在人类神经疾病的模拟方面具有天然优势且其在造模过程中生存率较高，因此成为制备AD模型的常用动物[8]。

目前，AD的发病机制存在多种假说。如Aβ毒性假说、胆碱能神经元假说、tau蛋白假说等[9]，但其发病机制并不明确。而AD的病理改变非常明确，主要是Aβ聚集形成的老年斑、神经纤维缠结和神经元死亡[10-11]。因此，AD理想的动物模型是动物脑组织出现类似AD患者的脑部病变。

本研究采用的两种动物模型都是经典的AD模型。研究表明Aβ在AD的发生发展中起着重要作用[12-13]，且在Aβ聚集区发现高浓度的金属离子，如铝、铜、铁等[14]，推测其与AD的发生有关。同时，铝可促进Aβ结构转变，加速Aβ生成和聚集[15]。除此之外，D-半乳糖是动物体内存在的一种糖，当含量过高时会转化为活性氧，导致机体出现氧化应激。亚硝酸钠在体内可转化为亚硝酸对神经系统产生毒性。因此，本实验主要比较侧脑室注射Aβ25-35和联合给予D-半乳糖、亚硝酸钠及三氯化铝两种造模方法，选取出更适合AD研究的动物模型。

实验开始前展开预实验。分别选取10只大鼠采用两种不同造模方法进行预实验。侧脑室注射Aβ25-35死亡率为40%，另一种造模方法未出现动物死亡。分析发现，侧脑室注射Aβ25-35时需要腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉过程中出现麻药直接注射到肠腔引起肠梗阻导致大鼠死亡。为减少死亡率，再次实验前对实验人员进行统一培训。结果表明，统一培训后，两种造模方法存活率无明显差异。水迷宫实验结果显示，在造模后1周，两模型组大鼠学习记忆能力均有明显损伤，但侧脑室注射Aβ能够在短期内更有效地损伤大鼠的认知能力。在造模后第5周，侧脑室注射Aβ的学习记忆能力与正常组相比差异无统计学意义，说明其学习记忆能力在造模后的第2～5周逐渐恢复。而联合给予D-半乳糖、亚硝酸钠及三氯化铝的大鼠其学习记忆能力损伤依然存在。实验结果表明，侧脑室注射Aβ的大鼠认知能力受损主要表现为急性损伤，适用于短期研究；联合给予D-半乳糖、亚硝酸钠及三氯化铝的大鼠其认知能力损伤能够保持较长时间，适用于AD的长期研究。