利用二硫化钨对单链DNA的特异性吸附实现microRNA的双组份检测

冯 程

(常德职业技术学院，湖南 常德 415000)

MicroRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，对人体生长、发育、生理和病理等过程具有重要作用。因此microRNA的特异性识别和定量检测对于基础性研究和临床诊断都是极其有意义的。本实验根据鲁米诺及石墨烯量子点的ECL反应机理，设计了以二硫化钨纳米片为感应平台的生物传感器，实现了对microRNA的双组份检测。首先利用二硫化钨纳米片对碱基数约为22的DNA单链的特异性吸附作用将标记了鲁米诺与石墨烯量子点的单链DNA吸附在滴有二硫化钨的电极表面，该两种单链DNA便吸附在了电极表面。此时由于WS2对鲁米诺和石墨烯量子点具有ECL增强作用，得到了一个较高的ECL信号。当加入目标物microRNA时，microRNA与单链DNA杂交形成双链离开电极表面，WS2不能增强其发光，得到了一个较低的ECL信号[1-3]。根据以上原理得到的ECL信号变化与两种目标物的浓度成一定的线性关系从而达到了同时检测两种microRNA的目的。随着对microRNA的深入研究以及microRNA在疾病诊断的生物学标记和药靶中作用的日益突出，该生物传感器可能会给人类疾病的治疗提供一个新的发展平台[4-5]。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪；CHI610A型电化学工作站；FA-2004A FA/JA系列电子天平；SB-80超声清洗机；TGL-20M高速台式冷冻离心机；移液枪；三电极体系：玻碳电极(GCE，Φ=4 mm)及其修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极；JBZ-12H磁力搅拌器用于石墨烯量子点的制备过程的搅拌。

氧化石墨烯；浓硝酸(分析纯AR)；浓硫酸(分析纯AR)；二硫化钨；过硫酸钾(分析纯AR)；鲁米诺；磷酸缓冲溶液(PBS，0.1 mol/L，pH 7.4)。所用其它试剂均为分析纯，实验用水均为二次去离子水。

本实验当中用到的所有寡核苷酸序列均合成于大连宝生物公司，并保存在4 ℃待用。

1.2 microRNA生物传感器的构建

玻碳电极的预处理：玻碳电极(Φ=4 mm)经0.3、0.05 μm的Al2O3糊抛光2 min后用蒸馏水冲洗干净，再在二次去离子水中超声洗涤3 min，清洗后的电极置于室温下晾干备用。

电极的自组装过程：用移液枪吸取15 μL WS2溶液滴于预处理后的玻碳电极表面，于烘箱中烘干成膜。在得到的修饰电极表面分别滴上10 μL DNA-LUMINOL 和5 μL DNA-GQDs，使其在36 ℃烘箱中孵育2 h后，将目标物microRNA-141和microRNA-155各5 μL滴于该电极表面上，在36 ℃烘箱中孵育2 h。

1.3 测试方法与检测原理

本实验中循环伏安法(Cyclic Voltammetry or CV)检测及ECL检测均采用三电极体系：经修饰的玻碳电极(Φ=4 mm)作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，铂电极为对电极。采用MPI-E型电致化学发光分析系统对修饰电极的电致化学发光行为进行研究，在2 mL的0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中，扫描电位为-1.6～0.8 V，均以200 mV/s电位扫描速度施加循环伏安(CV)扫描模式，温度均为室温。

2 结果与讨论

2.1 传感器制备过程ECL表征

a.miRNA-141/miRNA-155/DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸电极；b.DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸电极图1 传感器制备过程ECL表征Fig.1 ECL characterization of the proposed biosensor

2.2 传感器制备过程CV表征

通过测定修饰电极在5 mmol/LK3[Fe(CN)6]溶液中CV强度变化来表征传感器的制备过程，如图2所示：a曲线是裸电极的CV表征曲线，当WS2孵育在电极表面时CV信号有所降低(曲线b)，原因可能是由于WS2阻碍了电子传递。当DNA-LUMINOL和DNA-GQDs孵育在电极表面时，由于DNA大分子会阻碍电子传递，因此电流值减小得到了c曲线。当目标物miRNA-141和miRNA-155孵育在电极表面时，由于RNA链阻碍了电子传输，使CV信号再次降低，得d曲线。

a.裸电极，b.WS2/裸电极，c.DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸电极，d.miRNA-141/miRNA-155/DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸电极图2 传感器制备过程CV表征Fig.2 CV characterization of biosensor preparation process

2.3 ECL生物传感器的性能

2.3.1 ECL生物传感器的ECL信号响应特性

本实验研究了在最优条件下，ECL生物传感器孵育了浓度为1×10-15、5×10-15、1×10-14、1×10-13、5×10-12、5×10-11mol/L的microRNA-141标准溶液，其ECL信号如图8所示，电位在-1.6 V处的峰为141/GQDs的峰。实验结果表明，对于microRNA-141来说，其检测范围在1×10-15-5×10-11mol/L时线性回归方程为：y=2166.81 lgc+8400.14(c为microRNA-141的浓度)，相关系数R2=0.9953，检出限为1.7×10-16mol/L(S/N=3)。

在最优条件下，该ECL生物传感器孵育了浓度分别为5×10-16、5×10-15、1×10-14、1×10-13、5×10-12、5×10-11mol/L的microRNA-155标准溶液，其ECL信号如图3所示，电位在0.8 V处的峰为155/luminol的峰。实验结果表明，对于microRNA-155来说，其检测范围在5×10-16-5×10-11mol/L时线性回归方程为：y=2203.01 lgc+8676.00(c为microRNA-155的浓度)，相关系数R2=0.9963，检出限为3.3×10-16mol/L(S/N=3)。

图3 线性ECL图Fig.3 Sensitivity of the proposed biosensor

2.3.2 实际样品的检测

为了进一步证明microRNA在实际样品中的应用性，我们将从不同癌细胞中提取出的microRNA应用于本传感器中进行双组份检测。我们选用了Hela细胞(子宫颈癌细胞)与22RV1(人类前列腺癌细胞)两种细胞作为实际样品检测。结果如图4所示，我们可以看出当该生物传感器孵育了Hela裂解液之后，由于microRNA-141在Hela中的低表达，相对于空白样品来说，得到了较高的ECL响应；而microRNA-155在Hela细胞中的高表达，带走了电极表面的DNA-luminol，因此得到了较低的ECL响应。同理，由于microRNA-141在22RV1细胞中的高表达，我们得到了较低的ECL响应，而microRNA-155在22RV1细胞中相对较低的表达，得到了一个相对较高的ECL响应值。由此证明我们设计的生物传感器可以应用于实际样品的检测。

图4 在癌细胞裂解液中双组份检测miRNAFig.4 Multiplexed detection of miRNAs from different cancer cell Lysates

3 结 论

以ECL为基本检测手段，我们进行了microRNA双组份检测。本实验以二硫化钨纳米片为感应平台，利用二硫化钨纳米片对单链DNA的特异性吸附作用将其吸附在滴有二硫化钨的电极表面，其中单链DNA 1修饰有鲁米诺，单链DNA 2修饰有石墨烯量子点。由于WS2对鲁米诺和石墨烯量子点分别具有ECL增强效果，能得到一个较高的ECL信号。而当加入目标物时，microRNA-141和microRNA-155分别与单链DNA-LUMINOL和DNA-GQDs杂交形成双链离开电极表面，WS2不能增强其发光，得到一个较低的ECL信号，且随着目标物的浓度变化，ECL信号与其呈现线性关系。该生物传感器的响应原理和制备方法简单，并首次使用鲁米诺和石墨烯量子点实现了microRNA的双组份检测，具有良好的选择性和实际应用性。