临床常见病原菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性分析

吕红玲，刘春林，邓德耀，徐红云

云南省第二人民医院/云南大学附属医院检验科，云南昆明 650000

喹诺酮类药物是一类人工合成的抗菌药物，具有抗菌谱广、活性强、安全、廉价等优点，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有良好的抗菌活性，被广泛应用于各种细菌感染的治疗。但近年来，随着喹诺酮类抗菌药物的广泛及不合理使用，细菌耐药性逐渐增加[1]，给临床治疗带来较大困难。本研究对本院2015-2019年临床分离的病原菌菌群分布，以及主要病原菌对常用喹诺酮类抗菌药物(环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星)的耐药状况进行回顾性分析，旨在为医院感染监控和临床合理使用喹诺酮类抗菌药物提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集云南省第二人民医院2015-2019年住院及门诊患者进行细菌培养的各类标本的临床数据，包括标本种类、菌种鉴定及药敏情况，剔除同一患者同一部位重复菌株数据。

1.2仪器与试剂 VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪、革兰阴性菌鉴定卡(GN卡)、革兰阳性菌鉴定卡(GP卡)、革兰阴性菌药敏卡(ASTGN卡)、革兰阳性菌药敏卡(ASTGP卡)均购自法国生物梅里埃公司；抗菌药敏纸片购自英国OXOID公司；药敏试验用MH琼脂购自郑州安图生物工程股份有限公司。

1.3细菌鉴定和药敏试验 按常规方法进行细菌接种、培养、分离、鉴定和药敏试验，菌株鉴定和药敏试验采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪及相应药敏卡。药敏结果判断参照美国临床和实验室标准协会相关标准，必要时采用手工生化复核鉴定结果、纸片扩散法复核药敏结果。

1.4肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶检测 采用改良Hodge试验，用生理盐水制备0.5麦氏标准的大肠埃希菌ATCC25922(指示菌)菌悬液，再用生理盐水1∶10稀释，根据常规纸片扩散法程序接种于MH平板，干燥3～10 min，在平板中心贴10 μg厄他培南纸片，使用10 μL接种环挑取血琼脂平板过夜生长的3～5个试验菌落，从纸片边缘向外划直线，划线约20～25 mm。35 ℃培养16～20 h，孵育后，检查MH平板，在抑菌圈与试验菌株划线交叉处出现增强生长现象的为碳青霉烯酶阳性；采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪对产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)及耐甲氧西林葡萄球菌进行鉴定，必要时采用K-B纸片扩散法确认。

1.5质控菌株 采用大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、粪肠球菌ATCC29212和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株，均购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.6统计学处理 采用WHONET5.6软件进行耐药率统计，采用SPSS22.0统计软件对数据进行处理和分析，计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1菌株来源 2015-2019年共分离到27 663株非重复致病菌株，主要分离自呼吸道痰10 338株(37.37%)、创口分泌物/组织7 428株(26.85%)、血液3 770株(13.63%)和尿液2 824株(10.21%)，其他标本(胸腔积液、腹水、胆汁、生殖道分泌物和脑脊液等)3 303株(11.94%)。主要来源于ICU、普外科、创伤外科和神经外科等临床科室。

2.2病原菌分布 27 663株病原菌中革兰阴性菌共20 931株(75.66%)，革兰阳性菌6 732株(24.34%)。排列居前5位的肠杆菌科细菌和前5位的非发酵菌共18 548株，占全部革兰阴性菌总数的88.61%。排列居前5位的革兰阳性菌共4 994株，占全部革兰阳性菌总数的74.18%，见表1。

表1 病原菌分布情况

2.3病原菌对喹诺酮类药物的耐药情况 主要肠杆菌科细菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况见表2；主要非发酵菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况见表3；主要革兰阳性菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况见表4。

表2 主要肠杆菌科细菌对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药情况

表3 主要非发酵菌对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药情况

表4 主要革兰阳性菌对3种喹诺酮类抗菌药物的耐药情况(%)

2.4特殊菌株耐药情况 分别检测出产碳青霉烯酶的大肠埃希菌(CPEC)48株(0.70%)和产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(CPKP)584株(13.90%)。CPEC、CPKP对2种喹诺酮类抗菌药物(环丙沙星和左氧氟沙星)的耐药率明显高于不产碳青霉烯酶的菌株，差异有统计学意义(P<0.01)，见表5。分离到产ESBL的大肠埃希菌4 233株(61.96%)和产ESBL的肺炎克雷伯菌1 383株(32.92%)，产ESBL的菌株对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBL的菌株，差异有统计学意义(P<0.01)，见表6。分离到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)761株(32.55%)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)658株(72.55%)，甲氧西林耐药的葡萄球菌对3种喹诺酮类抗菌药物(环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星)的耐药率明显高于甲氧西林敏感菌株，差异有统计学意义(P<0.01)，见表7。

表5 产或不产碳青霉烯酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药情况(%)

表6 产或不产ESBL的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药情况(%)

表7 耐甲氧西林的葡萄球菌与甲氧西林敏感的葡萄球菌对3种喹诺酮类抗菌药物的耐药情况(%)

3 讨 论

本研究耐药性分析结果显示，在所有分离的病原菌中，喹诺酮类抗菌药物耐药率最高的前3位细菌分别为屎肠球菌(77.7%～90.8%)、鲍曼不动杆菌(42.1%～74.4%)和大肠埃希菌(49.0%～55.5%)。与同期CHINET细菌耐药监测报道的全国平均水平相比，肠杆菌科细菌中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率与全国平均水平相近；非发酵菌中铜绿假单胞菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均高于全国平均水平，鲍曼不动杆菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率与全国平均水平相近，嗜麦芽窄食单胞菌对左氧氟沙星的耐药率(17.8%～33.3%)高于全国平均水平(9.0%～11.7%)[2-6]，提示本院铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药形势严峻；革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌对环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率均呈逐年降低趋势，从2015年明显高于全国平均水平，至2017年与全国平均水平相近，到2018年低于全国平均水平[7-8]；屎肠球菌对上述3种抗菌药物的耐药率均在77%以上，与全国平均水平相近[7-8]。

本研究发现，CPEC和CPKP对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药率均明显高于CNEC、CNKP；产ESBL的大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌对2种喹诺酮类抗菌药物的耐药率均明显高于不产ESBL的菌株；甲氧西林耐药的葡萄球菌对3种喹诺酮类抗菌药物的耐药率明显高于甲氧西林敏感菌株，提示产碳青霉烯酶和产ESBL的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，甲氧西林耐药的葡萄球菌均具有较高的喹诺酮类耐药基因携带率。研究报道，耐碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌可携带多种耐药基因，其中喹诺酮类的耐药基因具有较高的携带率[9-10]；产ESBL的肠杆菌科细菌对喹诺酮类抗菌药物普遍耐药[11-12]；质粒介导的喹诺酮类耐药基因与AmpC β-内酰胺酶，ESBL和碳青霉烯酶相关，它们携带的基因位于具有多重耐药性的同一接合质粒上[9]；MRSA的氟喹诺酮类耐药基因携带率高于MSSA[13]，这些现象致使由这些微生物引起的各种感染性疾病的治疗更加复杂。早在2009年《喹诺酮类抗菌药在感染病治疗中的适应证及其合理应用：专家共识》就提到MRSA所致感染不宜选用氟喹诺酮类抗菌药物[14]；2015年《多重耐药菌医院感染预防与控制中国专家共识》中提到氟喹诺酮类不适于产ESBL肠杆菌科细菌的经验性治疗，可作为重症感染的联合治疗[15]；目前治疗产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌感染的药物主要为多黏菌素、替加环素、头孢他啶-阿维巴坦、磷霉素和氨基糖苷类[16]。本院2015-2019年CPEC检出率为0.70%，CPKP检出率为13.90%，产ESBL的大肠埃希菌检出率为61.96%，产ESBL的肺炎克雷伯菌检出率为32.92%，MRSA检出率为32.55%，MRSE检出率为72.55%，值得注意的是MRSA对环丙沙星和左氧氟沙星耐药率均>70%，明显高于CHINET细菌耐药监测研究结果(环丙沙星检出率为32.7%，左氧氟沙星检出率为34.0%)[8]。所以，动态监测细菌对喹诺酮类药物的耐药性变化，并对重点细菌耐药机制进行研究，掌握细菌耐药流行趋势，有助于指导临床合理用药。

细菌对喹诺酮类药物的耐药机制比较复杂，主要是由染色体介导的靶位点拓扑异构酶的改变和细胞内药物蓄积的减少，以及由可传递质粒所编码的Qnr蛋白的保护机制所致[17]。喹诺酮类抗菌药物耐药菌株的产生有医源性、动物源性和食物源性，有关研究报道，医院喹诺酮类、头孢菌素和四环素的使用概率与大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药的发生率呈正相关[18]；左氧氟沙星使用概率与铜绿假单胞菌、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌和肠杆菌属耐药率均呈高度正相关[19]；但也有研究报道左氧氟沙星使用概率与大肠埃希菌的耐药率呈负相关[20]，提示喹诺酮类药物用量与其耐药的关系非常复杂，仍需深入研究。要减少多药耐药菌株的产生，应注意合理使用抗菌药物。此外，喹诺酮类药物由于安全性高、价格低廉等优点被广泛运用于畜牧业和水产养殖业，一方面它可直接导致细菌的耐药性产生，另一方面它通过食物链进而促使人体内部菌群的耐药性产生。

综上所述，本院喹诺酮类抗菌药物耐药率最高的前3位细菌分别为屎肠球菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌，但与CHINET细菌耐药监测网报道的耐药率相比，铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和MRSA对喹诺酮类抗菌药物耐药形势较为严峻。临床医生应严格掌握喹诺酮类药物使用的适应证，关注当地医院的细菌耐药现状和变化趋势，严格控制细菌耐药率较高的抗菌药物的临床使用，以减少抗菌药物的选择性压力；动态监测临床常见病原菌对喹诺酮类药物的耐药性变化，了解耐药机制的产生，指导临床合理用药，最大限度发挥喹诺酮类药物的作用。