液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中林可霉素残留量的不确定度评定

◎ 石雪芬，范明志，蒋 龙，石美莲，陈金余

（深圳信测标准技术服务有限公司，广东 深圳 518000）

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

前处理使用的试剂甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯；氢氧化钠、磷酸氢二钠、无水硫酸钠和氯化钠为AR级别；流动相使用的试剂乙腈、甲酸铵均为质谱纯；林可霉素标准物质纯度93.9%，纯度偏差±1.0%，生产厂家为中国食品药品检定研究院。

15%乙腈水溶液：150 mL甲醇与850 mL水混合；甲酸铵溶液：0.1 mmol·L-1。0.63 g甲酸铵加水溶解至1 000 mL；2%氯化钠溶液：称取10.0 g氯化钠，溶解于500 mL水中；磷酸盐缓冲溶液：0.1 mol·L-1。6.0 g磷酸氢二钠溶解于450 mL水中，用氢氧化钠饱和溶液调节pH=8，用水定容至500 mL，使用前配制；甲醇+水溶液（2+3）：400 mL甲醇与600 mL水混合，使用前配制。

1.2 仪器与设备

液相色谱-质谱联用仪：Triple Quad 4500；旋转蒸发器：北京恒奥德HAD-XZF2；万分之一电子天平：上海精其FA2204N；水浴氮吹仪器：北京恒奥德H30102；多管涡旋混旋仪：上海精其LF-200 ；台式离心机：凯特TD5；固相萃取装置：北京恒奥德H27666

1.3 方法

按GB/T 20762—2006采用液相色谱-质谱/质谱法测定鸡肉中林可霉素残留量。通过对实验过程各不确定度来源分析、计算和合成，从而评定其不确定度。

称取5 g试样，置于50 mL离心管中，加入20.0 mL乙腈，于振荡器上剧烈振荡20 min，再加入2.0 g无水硫酸钠、1 g氯化钠和3.0 mL正己烷，于振荡器上剧烈振荡10 min。以3 500 r·Lmin-1的转速离心5 min，取乙腈于鸡心瓶中，于55 ℃水浴中旋蒸至近干左右，待净化。

用7 mL磷酸盐缓冲溶液分两次溶解残液，使样液以小于1.0 mL·min-1的流速通过Oasis HLB固相萃取柱。样液全部流出后，再用10 mL水和5 mL甲醇十水溶液洗柱，弃去全部流出液，固相萃取柱用真空泵抽干1 h。再用10 mL甲醇洗脱于15 mL锥形试管中，用氮气浓缩仪于55 ℃水浴中吹至近干，准确加入

1.0 mL 15%乙腈水溶液溶解残渣。过0.2 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2 数学模型分量的来源及分析

鸡肉中林可霉素残留量定量检测计算公式为：

式中：X-样品中9种大环内酯类的含量，mg·kg-1；C-根据工作曲线计算的样品溶液的浓度，μg·mL-1；V-定容体积，mL；m-样品质量，g；1 000-单位换算。由上述公式可见，根据不确定度的传播定律，可得到被测样品中被测物含量X的不确定度u(p)计算公式（2），9种大环内酯类不确定度的因果关系鱼骨图分析如图1所示[1]。

式中：u(p)-林可霉素浓度的相对标准不确定度；u(Cstd)-林可霉素标准储备液引入的相对标准不确定度；u(m)-样品称量天平和称量重复性的不确定度；u(Vsample)-样品提取定容引入的相对标准不确定度；u(A)-重复测定样品引入的相对标准不确定度。

3 林可霉素的不确定度分量计算

3.1 标准溶液浓度的不确定度

3.1.1 林可霉素标准物质纯度产生的相对不确定度

林可霉素93.9%，纯度偏差±1.0%，生产厂家，中国食品药品检定研究院。按供应商目录所给纯度，假定均匀分布，林可霉素相对标准不确定度为

3.1.2 称量标准物质时产生的相对标准不确定度称量引入的不确定度来自两个方面。

（1）称量变动性，在50 g以内，变动性标准偏差为0.08 mg。

（2）用十万分之一天平称取10 mg标准物质于10.00 mL容量瓶中，用乙腈-水（3∶7体积比）溶液定容至刻度，此标准储备溶液为1 mg·mL-1。天平的校准证书给出在95%置信水平时，不确定度为0.3 mg，按照正态分布考虑评定其标准不确定度。查表得，当置信水平p＝95%时，k＝1.96。林可霉素的相对标准不确定度为上述两项合成得出称量的标准偏差为：

3.1.3 配制储备液时产生的相对标准不确定度

使用10.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1标准储备液，其不确定度包括3个部分。

（1）由于玻璃的膨胀系数很小，因温度引起的体积变化此处可以忽略不计。

（2）容量瓶体积的不确定度，按《实验室玻璃仪器 单标线容量瓶》（GB/T 12806—2011）规定，A级单标线10.00 mL容量瓶的容量允许差为±0.02 mL，按均匀分布，用容量瓶配置标准储备液的相对标准不确定度均为：

（3）充满液体至容量瓶刻度的估读误差，根据经验得估读误差为0.05 mL，分布考虑矩形分布，其引入的标准不确定度为：则用10.00 mL容量瓶配制1.0 mg·mL-1标准储备液的相对标准不确定度为：

3.1.4 稀释工作液时产生的相对标准不确定度

1 mg·mL-1标准储备液稀释至10 μg·mL-1的标准中间液。先用1 mL的吸量管移取1 mL的标准储备液至100.00 mL容量瓶中，定容至刻度。用1.00 mL的吸量管移取0.10 mL的100 ng·mL-1的标准中间液至100.00 mL容量瓶中，定容至刻度。其不确定度包括2次100.00 mL容量瓶和2次1.00 mL移液管的相对不确定度。

（1）1 mL移液管容量允差参照《实验室玻璃仪器 分度吸量管》（GB 12807—1991）规定：1.00 mL标称容量的允许差为±0.008 mL，按均匀分布计算标准偏差为[3]：

（2）由于玻璃的膨胀系数很小，因温度引起的体积变化此处可以忽略不计。

（3）100.00 mL容量瓶允差参照《实验室玻璃仪器 单标线容量瓶》（GB 12806—2011）规定，100.00 mL标称容量的允许差为±0.1 mL，按均匀分布，其引入的标准不确定度为：

（4）充满液体至容量瓶刻度的估读误差，根据经验得估读误差为0.05 mL，考虑矩形分布，其引入的标准不确定度为：

则用100.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1标准储备液的相对标准不确定度为：

1 mg·mL-1标准储备液稀释至10 μg·mL-1的标准中间液，10 μg·mL-1的标准中间液稀释至100 ng·mL-1的标准使用液的相对标准不确定度均为：

综上所述，配制林可霉素准储备液引入的相对标准不确定度为：

3.2 样品称量的不确定度

称量鸡肉样品的质量为5.001 7 g，称量不确定度来自两个方面[4]。

（1）称量变动性，在50 g以内，变动性标准偏差为0.08 mg。

（2）天平校正产生的不确定度，准证书给出的在95%置信概率时为0.3 mg，按照正态分布考虑评定其标准不确定度。查表得，当置信水平p＝95%时，k＝1.96，换算成标准偏差为0.3/1.96＝0.153 1 mg。

由上述两项合成得出称量的标准偏差为：

3.3 样品定容体积的标准不确定度

样品定容至1.0 mL容量瓶中，其不确定度包括3个部分。

（1）由于玻璃的膨胀系数很小，因温度引起的体积变化可以忽略不计。

（2）容量瓶体积的不确定度，按《实验室玻璃仪器 单标线容量瓶》（GB/T 12806—2011）规定，A级单标线2 mL容量瓶的容量允许差为±0.01 mL，按均匀分布，用容量瓶配置标准储备液的相对标准不确定度均为：

（3）充满液体至容量瓶刻度的估读误差，根据经验得估读误差为0.01 mL，考虑矩形分布，其引入的标准不确定度为：

则用10.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1标准储备液[5]的相对标准不确定度为：

3.4 重复测定的标准不确定度u(A)

重复测定6次，结果见表1，假定均匀分布，相对标准不确定度为：

表1 重复测定6次的数据结果表

4 林可霉素的合成不确定度

林可霉素的合成不确定度为：

5 林可霉素的扩展不确定度

取包含因子k=2，置信水平约为95%，则扩展不确定度为：

6 结果报告

从测量评定分析结果可看出，本方法不确定度分量最大的是样品重复测定引入的不确定度，其次是标准溶液引入的不确定度和样品重复性引入的不确定度。当林可霉素残留量为2.71 μg·kg-1时，测定结果表示为（2.71±0.084）μg·kg-1，k=2。