蒿属香豆素对MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠保护性作用的研究

蔡 菁 ，葛亚强 ，许丽娟 ，陆华美

(1.江苏大学附属武进医院，江苏 常州 213017;2.徐州医科大学武进临床学院，江苏 常州 213017)

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)发展始于脂肪肝，经非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后随着病情进一步恶化，发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，还会增加患者心血管疾病的发病风险[1-2]。随着生活方式和饮食结构的改变，肥胖、糖尿病、代谢综合征全球化流行，NAFLD的发病率也逐渐升高。因此，及时治疗显得至关重要。目前，研究认为肝过度摄入脂肪和氧化应激在NAFLD 的病理发展过程中有十分重要的作用[3]。然而针对NAFLD 还未有疗效显著的治疗方案，临床上主要通过干预患者生活方式、保肝护肝、降脂调脂、调节肠道菌群等方式改善症状，目前为止，临床缺乏疗效确切的抗肝纤维化药物。中药具有多环节、多靶点的作用特点，对病理机制复杂的疾病可发挥综合优势，近年来，实践证明中医药在抗器官纤维化中具有良好作用与发展前景[4-7]。

中医治疗肝纤维化的主要方法是辨证论治，抗肝纤维化药物中主要包含中药有丹参、黄芪、川芎等[8-10]。由茵陈、栀子、大黄组成的茵陈蒿汤具有抗炎、抑制肝脂肪变性，抗凋亡、坏死，保护肠道黏膜屏障和免疫调节的作用[11-12]。茵陈药理学研究显示具有利胆、降脂、解热抗炎、护肝等作用。主治：黄疸、肝炎等，而蒿属香豆素(Scoparone)是中药茵陈的主要成分，已有研究结果表明，蒿属香豆素具有广泛的药理活性，包括降血脂、抗炎、抗氧化、抗凋亡等[13]。本实验探讨蒿属香豆素这一中药成分在蛋氨酸胆碱缺乏(Methionine-choline-deficient，MCD)诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠中作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性ICR小鼠，体重20 g左右，SPF级，购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010，饲养于江苏大学实验动物中心，饲养条件为室温21～23 ℃，湿度55%～65%。

1.2 试剂与仪器 蒿属香豆素、丹酚酸B购自美国Sigma公司、平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型胶原抗体、转化生长因子β1(Transforming growth factor beta,TGF-β1)蛋白抗体、E钙黏蛋白抗体购自Abcam公司，MCD饲料及普通饲料购自江苏美迪森生物医药公司。AST、ALT、BUN、Cr检测试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)试剂盒购自南京建成公司。波形蛋白抗体、Smad2/3总蛋白、p-Smad2/3抗体购自美国CellSignaling Technology公司，Smad7抗体购自美国Santa cruz公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组：将50只20 g左右的雄性小鼠适应性喂养1周后随机分为五组，每组10只，分别为空白对照组、模型组、丹酚酸B组、蒿属香豆素低剂量组、蒿属香豆素高剂量组。

1.3.2 造模：除空白对照组外，其余组饲喂MCD饲料。

1.3.3 给药：造模后1周，蒿属香豆素低剂量组给予30 mg/kg蒿属香豆素灌胃(初始灌胃浓度为2 mg/ml)，香豆素高剂量组每日给予60 mg/kg灌胃(初始浓度为4 mg/ml)，丹酚酸B组给予10 mg/kg灌胃(初始浓度为0.67 mg/ml)，后期根据体重变化，调整浓度，空白对照组和模型组给予等体积(0.3 ml)的0.9%氯化钠溶液灌胃，5周后取小鼠肝脏组织和血清进行实验。

1.4 观察指标

1.4.1 小鼠体重和肝重测定:称取各组小鼠体重肝湿重，并计算肝脏指数。肝脏指数(%)=肝脏重量(g)/体重(g)×100%。

1.4.2 对肝脏组织进行病理检查:NASH病理诊断标准采用NAFLD活动度积分(NAFLD Activity Score，NAS)进行评估[14]。

1.4.3 通过试剂盒检测各组小鼠血清生化指标：按说明书步骤将各组血清样本加入不同试剂中。通过紫外分光光度计或酶标仪检测各指标的OD值。参照说明书公式计算血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的含量。

1.4.4 比色法测肝脏组织MDA和SOD含量：取肝脏组织于匀浆器中，加入适量PBS溶液，制备5%或10%组织匀浆。按试剂盒说明书步骤加入样本和试剂，检测各管吸光度值，根据说明书公式计算各组MDA和SOD含量。

1.4.5 Western blot方法测小鼠肝脏组织液α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、E钙黏蛋白、波形蛋白、TGF-β1，Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7表达：称取适量肝脏组织，并用PBS冲洗剪碎后放入匀浆器中，加入5倍体积裂解液于组织中，快速匀浆。组织液吸出置于EP管中，14000 g离心15 min，取上清。BCA法检测蛋白浓度，记录数据。 上样缓冲液中加入总体积1/20的β-巯基乙醇,蛋白与上样缓冲液按4∶1混合；100 ℃水浴下煮沸15 min，瞬离后置于-20 ℃冰箱备用，若长期保存，应置于-70 ℃冰箱或液氮。 电泳、转膜及显影：10% SDS-PAGE垂直电泳后电转移到PVDF膜，封闭1 h后，与特异性α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、E钙黏蛋白、波形蛋白、TGF-β1、总Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜三次，每次15 min，加入相应二抗以结合一抗，37 ℃孵育1 h。洗膜后显影并分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间差异显著性检验采用单因素方差分析及两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。采用Image J计算蛋白灰度相对表达量。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般状况和体重、肝重等变化 空白对照组小鼠的生活状态较好，食纳正常，毛发的光泽正常；模型组小鼠随造模时间延长，进食量开始减少，毛发的光泽度比空白对照组差，精神变得相对萎靡。而最终体重结果显示，空白对照组小鼠增加，模型组减少。造模后的小鼠肝脏可见到颜色偏黄白，表现为脂肪变性，仔细观察，部分模型组肝脏的表面出现少许结节，而空白对照组的小鼠肝脏表面光滑，无脂肪变性。各治疗组小鼠肝脏表面无明显的脂肪变性，颜色较空白对照组更深，尤其高剂量香豆素组，需考虑与肝脏代谢药物可能有关(图1)。

实验开始时，各组小鼠体重基本一致，无统计学差异。饲养6周后，模型组和各治疗组小鼠体重与空白对照组相比均显著降低(P<0.01)，各治疗组与模型组相比，体重增加(P<0.01)。模型组肝脏指数明显上升，显著高于对照组(P<0.01)，各治疗组与模型组相比，肝脏指数明显下降(P<0.01)。蒿属香豆素高剂量、低剂量组之间差异有统计学意义(P<0.05)，但与丹酚酸B组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

A：空白对照组；B:模型组；C:丹酚酸B组；D:香豆素低剂量组；E:香豆素高剂量组图1 各组小鼠肝脏外观

表1 蒿属香豆素对小鼠体重、肝重和肝脏指数的影响

2.2 各组小鼠肝脏病理变化 HE染色显示，空白对照组肝脏组织形态结构正常，汇管区无炎症细胞浸润；无脂肪变性。模型组肝脏组织可见大面积脂肪样变，炎症细胞浸润，肝细胞严重空泡化，窦周可见胶原纤维形成，肝小叶结构紊乱。丹酚酸B组、蒿属香豆素高、低剂量组脂滴面积较模型组减少(图2)。Masson染色可见空白对照组小鼠的肝脏组织无染色，没有胶原沉积，模型组汇管区及汇管区周围窦周纤维化，各治疗组胶原沉积明显较模型组减少(图3)。

A：空白对照组；B:模型组；C:丹酚酸B组；D:香豆素低剂量组；E:香豆素高剂量组图2 蒿属香豆素对小鼠肝脏病理形态的影响(HE染色，×200)

A：空白对照组；B:模型组；C:丹酚酸B组；D:香豆素低剂量组；E:香豆素高剂量组图3 蒿属香豆素对小鼠肝脏病理形态的影响(Masson染色，×200)

2.3 小鼠肝组织NAS评分 见表2。NAS评分是非酒精性脂肪性肝病的诊断标准，小于3分排除NASH，大于4分即为NASH，介于两者之间者可能是NASH。与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏NAS 评分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，各治疗组小鼠NAS 评分明显下降(P<0.01)，说明均能明显改善MCD 诱导的NASH。高剂量蒿属香豆素组较低剂量组评分降低(P<0.05)，比丹酚酸B组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠肝脏组织NAS 评分(分)

2.4 蒿属香豆素对小鼠生化指标的影响 见表3。模型组血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)较正常组小鼠升高，蒿属香豆素及丹酚酸B组AST，ALT较模型组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。各组间尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 蒿属香豆素对脂肪性肝纤维小鼠生化指标的影响

2.5 蒿属香豆素对小鼠肝脏MDA和SOD水平的影响 见表4。与空白对照组比较，模型组MDA的含量明显升高(P<0.01)，SOD的含量显著下降(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组MDA的含量明显降低(P<0.01)。同时，各组的SOD的含量显著增高(P<0.01)。与香豆素高剂量组相比，香豆素低剂量组MDA明显增高，SOD水平降低(P<0.01)。而香豆素高剂量组与丹酚酸B组、低剂量组之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 蒿属香豆素对小鼠肝脏MDA和SOD水平的影响

2.6 各组纤维化、EMT指标及TGF-β/Smad通路蛋白表达的变化 见图4、5(表5、6)。Western blot结果显示，与空白对照组相比，模型组α-SMA、Ⅰ型胶原、波形蛋白的相对表达量明显升高，E钙黏蛋白的表达量下降，与模型组相比，丹酚酸B组和不同剂量蒿属香豆素组能显著降低α-SMA、Ⅰ型胶原、波形蛋白的表达量，增加E钙黏蛋白的表达量。模型组TGF-β1、p-Smad2/3表达较空白对照组明显升高(P<0.05)，而各治疗组能显著降低TGF-β1、p-Smad2/3蛋白的表达量，增加Smad7蛋白的表达量。各组与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。对于纤维化指标(α-SMA、Ⅰ型胶原)，蒿属香豆素高低剂量组存在统计学差异(P<0.05)，但其余指标各治疗组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

A：空白对照组；B:模型组；C:丹酚酸B组；D:香豆素低剂量组；E:香豆素高剂量组图4 蒿属香豆素对各组纤维化、EMT指标影响

表5 蒿属香豆素对各组纤维化、EMT指标影响

A：空白对照组；B:模型组；C:丹酚酸B组；D:香豆素低剂量组；E:香豆素高剂量组图5 蒿属香豆素对TGF-β/Smad通路蛋白表达的影响

表6 蒿属香豆素对各组TGF-β1通路蛋白影响

3 讨 论

非酒精性脂肪肝病随着病情进展，易发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，随着生活方式和饮食结构的改变，肥胖、糖尿病、代谢综合征全球化流行，NAFLD的发病率也逐渐升高。NAFLD长期发展的结果必将导致非NASF。肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是肝损伤持续存在、组织发生修复反应时因细胞外基质合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程，如果损伤因素长期存在，将增加发展为肝硬化甚至肝癌的可能性，严重威胁人类健康。在中医学中，非酒精性脂肪肝虽然没有统一病名，但根据其疾病特征和临床表现可归属于“肥气”“胁痛”“积聚”“痰痞”等范畴，非酒精性脂肪肝的发病与痰、湿、瘀、热等病理因素密切相关，痰瘀互结为其基本病机，湿热蕴结证为其常见证型。祛湿化瘀方是以祛湿化瘀治法为基础拟定的临床行之有效治疗NAFLD 的常见中医方剂，而茵陈就是其中重要的药味组成[15]。

细胞因子、细胞外基质沉积及氧化等多个复杂因素均会造成组织、器官的纤维化。中药及其主要成分对病理机制复杂的疾病可发挥综合优势，许多中药有明显抗氧化、治疗NASH、抗纤维化等作用[16-18]。抗氧化剂在对抗纤维化中有明显效果，为中医药治疗肝纤维化提供大量研究基础。中药组成通常较多，即使是单味药包含的成分也通常有数十种，提取其中主要相应药理学成分进行特异性治疗，不仅能提高疗效，还能降低不良反应，所以在本实验主要研究中药的主要提取成分。蒿属香豆素是中药茵陈蒿的主要成分，已有研究表明香豆素具有抗氧化等作用[19]。丹参中的主要提取物丹酚酸B，是目前公认的抑制肝纤维化的中药成分之一，并且对非酒精性脂肪肝有明确的保护性作用[8,20]，本实验中作为阳性对照。

本实验通过构建NASH模型，给予蒿属香豆素和丹酚酸B灌胃5周后，发现能有效抑制氧化、纤维化过程。本研究发现，与模型组相比，空白对照组小鼠和各治疗组平均体重升高、肝脏湿重与小鼠体重的比率均明显下降。各治疗组较模型组相比，肝功能好转，各组小鼠肾功能指标并没有明显差别，可见几组治疗药物没有明显损伤小鼠的肝肾功能，且对肝脏有保护作用。HE染色发现，各治疗组脂滴面积较模型组减少，明显减轻了肝脏的脂质沉积。Masson染色可见模型组小鼠胶原沉积明显，蒿属香豆素和丹酚酸均能减少胶原沉积，高剂量蒿属香豆素组较低剂量蒿属香豆素、丹酚酸B组效果更明显。

氧化应激是指多种因素造成的机体或细胞内活性氧(Reactiveoxygen species,ROS)过度产生，抗氧化防御功能减弱，严重破坏两者之间的平衡，造成组织或细胞损伤的一种状态。自由基于膜磷脂发生过氧化反应后产生MDA，可引起细胞膜结构和功能的紊乱，SOD作为生物体内重要的抗氧化酶，主要参与生物体内氧自由基的清除过程。蒿属香豆素和丹酚酸均能有效减轻小鼠体内的氧化过程，提高小鼠的抗氧化能力，两者相比较，高剂量的香豆素抗氧化作用更强，高剂量香豆素组抗氧化能力明显高于低剂量组，这些与多年来国内外研究认为蒿属香豆素具有较强抗氧化能力的结果相一致。α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达能有效反应纤维化的水平，本研究发现，蒿属香豆素和丹酚酸都能明显减少其表达，同时高剂量的香豆素效果比低剂量更明显，高剂量组与丹酚酸B之间抗纤维化差异并不明显。

上皮-间质转化(Epithelial-to-mesenchymal,EMT)在人体中发挥着重要的生物学功能，目前认为EMT 与多种器官纤维化联系密切，如肾、肺、眼、肝等[21]。研究发现EMT有利于纤维化的早期诊断，通过药物扭转EMT过程为治疗纤维化提供了新思路。ECM对EMT的发生和进展起着重要的作用，在EMT 过程中表型标志的改变，主要包括上皮细胞分子标志(如E钙黏蛋白)的表达下降或丧失和一些间质细胞标志(如波形蛋白)的新表达或表达上升。本实验中发现MCD饮食诱导的NASH活化过程中伴随EMT的发生，蒿属香豆素可以明显减少波形蛋白，增加E钙黏蛋白的表达，逆转EMT的过程。

TGF-β1是常见的促纤维化因子，Smads是TGF-β信号传导过程中最重要的胞内效应因子，它既是胞内信号分子，又有转录激活作用。TGF-β/Smad通路一直被认为是在许多脏器纤维化中起着重要作用[22-23]。本研究发现蒿属香豆素能明显减少TGF-β1的表达，各组组织总Smad2/3表达接近时，蒿属香豆素明显抑制p-Smad2/3的表达，同时增加了Smad7这一保护性蛋白的表达。

综上所述，蒿属香豆素通过抑制TGF-β1/Smad通路减轻肝脏炎症，改善NASH，提高抗氧化能力，改善纤维化、逆转EMT等方面有着一定作用。通过研究抗氧化剂对纤维化的作用，进一步探讨氧化与纤维化之间相互关系，EMT的影响及相关分子机制，将为传统中医药理论的现代研究奠定基础。