基于平衡TF/TFPI水平研究三七在心房颤动大鼠治疗中维持抗凝/出血稳态的作用及机制

王 辉，袁 捷，韩祖成，刘冬玲，陈 杰，RASSUL(哈萨克斯坦)

(1.天津中医药大学，天津 301617；2.西安市中医医院，陕西 西安 710021；3.陕西省中医医院，陕西 西安 710003;4.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

心房颤动 (Atrial fibrillation,AF)是一种常见的心律失常,可导致血栓栓塞疾病,引起脑卒中及体循环栓塞事件[1-2]，危及患者生存质量。抗凝治疗在房颤血栓栓塞疾病治疗中居于首位，目前预防房颤血栓栓塞的口服药物包括维生素K拮抗剂、抗血小板药物和 NOAC等[3-5]，虽然这些药物已经在临床取得显著疗效，但仍存在许多局限性，如治疗窗范围小、个体差异大，受食物、药物、酒精、年龄和某些疾病等影响大，出血风险高，需要定期采血监测INR水平等，抗凝不足或过度，而引发的血栓栓塞或出血事件是影响抗凝药物应用的主要原因[6]。体内凝血过程的始动和病理性血栓形成的关键是凝血Ⅲ因子，即组织因子(Tissue factor，TF)途径的启动，当血管损伤时，在Ca2+的参与下，细胞表面表达的TF与血液内的 FⅦ结合，使FⅦ很快被激活为活性形式FⅦa，形成TF/FⅦa复合物，启动凝血级联反应。组织因子途径抑制物(Tissue factor pathway inhibitors，TFPI)是TF及其复合物内源性抑制因子，TF及其复合物对凝血因子的激活过程受到TFPI的调控。TF途径被过度激活和(或)TFPI活性降低均可引起高凝状态，从而使机体更易形成血栓；相反，则容易引起出血[7-9]。因此，平衡 TF、TFPI 蛋白表达水平是维持抗凝/出血稳态的重要因素。三七为五加科人参属，味甘、微苦,性温,归肝、胃、心、小肠经,《本草纲目》最早记载三七具有止血化瘀、消肿止痛等功效[10]。有研究[11-12]表明，三七具有止血、抗心律失常、抗心肌缺血、脑保护、镇静止痛、抗炎等作用，在心血管系统、循环系统、神经系统等多系统发挥作用，不仅能发挥活血作用,而且能够协调发挥止血作用,三七以其“活血不伤气、止血不留瘀”双向调节特点在抗凝治疗中发挥优势。本研究从平衡TF、TFPI水平方面，研究三七对AF大鼠眼眦静脉血液TF、TFPI表达水平、血凝系列、抗凝/出血风险的影响，来探讨三七维持抗凝/出血稳态的可能作用机制，为中药抗凝治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠24只，250～300 g，雄性，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物生产质量合格证号：SCXK(沪)2018-0004。饲养于25 ℃空调动物房，相对湿度50%～70%，光暗周期为12 h∶12 h，大鼠可以自由摄食饮水。

1.1.2 实验药物及试剂：三七粉，陕西兴盛德药业有限责任公司，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠注射液配置为所需浓度的溶液。华法林购自上海信谊九福药业有限公司，批号：18190513，临用前用0.9%氯化钠注射液配置为所需浓度的溶液。0.9%氯化钠注射液：安徽双鹤药业有限责任公司，批号：1907202V。羧甲基纤维素钠：国药集团化学试剂有限公司，批号：F20111021。水合氯醛：上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20190823，规格：250 g/瓶。临用前用0.9% 氯化钠注射液配制成浓度为3%的溶液。无水氯化钙(CaCl2)：西陇科学股份有限公司，批号：1706262。临用前称取0.4 g的CaCl2，加0.9% NaCl注射液至20 ml，制成20 mg/ml的溶液，与132 μg/ml的乙酰胆碱溶液等体积混合。乙酰胆碱(ACh)：生工生物工程股份有限公司，批号：F522BA0014，规格：5 g/瓶。临用前称取2.64 mg的ACh，加0.9% 氯化钠注射液至20 ml，制成132 μg/ml的乙酰胆碱溶液，与20 mg/ml的CaCl2溶液等体积混合。大鼠TF ELISA 试剂盒：48 T/盒，上海酶联生物科技有限公司；批号：Aug 2020。 大鼠TFPI ELISA 试剂盒：48 T/盒，上海酶联生物科技有限公司；批号：Oct 2020。

1.1.3 实验仪器：HW-1000超级恒温水浴锅产自成都泰盟科技有限公司。BS 224s型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。BL420生理记录仪：成都泰盟科技有限公司。Coagu Chek XS(Roche)便携式血凝仪检测血凝系列。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备：模型组、三七组、华法林组均建立心房颤动模型[13]。新鲜配置乙酰胆碱-氯化钙混合液(ACh-CaCl2混合液)，内含ACh 99 μg/ml，CaCl210 mg/ml，称大鼠体重，10%水合氯醛(2.5～3 ml/kg)腹腔麻醉后，将大鼠固定于鼠板，BL420生理记录仪描记标准Ⅱ导联心电图，每日重复尾静脉注射(1 ml/kg)乙酰胆碱-氯化钙溶液(含66 μg/ml乙酰胆碱和50 mg/ml氯化钙)，连续造模7 d，以制备房颤大鼠模型，心电图全程记录，有典型房颤改变(R-R间期不等、P波消失、出现小f波)为造模成功。假手术组每日尾静脉注射(1 ml/kg)0.9%氯化钠溶液，共7 d。模型成功标准:房颤心电图：R-R间期不等、P波消失、出现小f波。

1.2.2 实验分组、给药及取材：24只大鼠适应性喂养 7 d后，随机分为四组：假手术组、模型组、三七组、华法林组，每组6 只。假手术组：灌胃3 ml 0.9%氯化钠溶液；模型组：灌胃3 ml 0.9%氯化钠溶液；三七组：造模成功后，给予三七粉0.315 g/(kg·d)溶于 3 ml 0.9%氯化钠溶液，灌胃；华法林组：造模成功后，给予华法林0.3125 mg/(kg·d)溶于3 ml 0.9%氯化钠溶液，灌胃；所有灌胃操作均每日 1 次，从造模第1天开始，连续至第7天。假手术组、模型组、华法林组大鼠在每个时间点(灌胃后第 3 天、第7天)用 10%水合氯醛(2.5～3 ml/kg)腹腔麻醉后，从眼眦静脉取血，收集血标本待检。

1.3 观察指标

1.3.1 ELISA法检测大鼠血浆 TF、TFPI水平：将各组大鼠不同时间点血标本以 3.8%枸橼酸钠 1∶9 抗凝，3000 r/min 离心10 min，按 ELISA 试剂盒说明书操作分别检测各组大鼠血浆 TF、TFPI水平。

1.3.2 即时检测技术(POCT)检测大鼠血凝系列：将各组大鼠不同时间点血标本以 3.8%枸橼酸钠 1∶9 抗凝，3000 r/min 离心10 min，按Coagu Chek XS(Roche)便携式血凝仪检测说明书操作分别检测各组大鼠国际标准化比值(International normalized ratio,INR)、部分凝血酶时间(Partial thrombin time,PT)。

1.3.3 观察大鼠皮下出血情况：在房颤模型建立及治疗过程中，观察大鼠有无皮下出血点，并做记录。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用多样本方差分析；不同时间点各均数间的比较行重复测量方差分析，两两比较行LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血浆TF水平比较 见表1。治疗第3天，与假手术组比较，其他各组TF值均明显升高(P<0.05)；华法林组、三七组与模型组TF相比，均有统计学差异(P<0.05)；而华法林组与三七组相比无统计学差异(P>0.05)。治疗第7天，与假手术组比较，其他各组TF值均明显升高(P<0.05)；华法林组、三七组与模型组TF相比，均有统计学差异(P<0.05)；华法林组TF水平与三七组相比无统计学差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠血浆TF水平比较(pg/ml)

2.2 各组大鼠血浆TFPI水平比较 见表2。治疗第3天，与假手术组比较，其他各组TFPI值均明显升高(P<0.05)；华法林组、三七组与模型组TFPI相比，均有统计学差异(P<0.05)；而华法林组与三七组相比无统计学差异(P>0.05)。治疗第7天，与假手术组比较，其他各组TFPI值均明显升高(P<0.05)；华法林组、三七组与模型组TFPI相比，均有统计学差异(P<0.05)；华法林组与三七组相比TFPI水平有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组大鼠血浆TFPI水平比较(ng/ml)

2.3 各组大鼠INR值比较 见表3。治疗第3天，与假手术组比较，其他各组INR值均明显降低(P<0.05)；模型组、华法林组和三七组INR值相比无统计学差异(P>0.05)；治疗第7天，与假手术组比较，其他各组INR值均有统计学差异(P<0.05)；华法林组、三七组与模型组INR值对比均有统计学差异(P<0.05)，华法林组与三七组INR值对比有统计学差异(P<0.05)。

表3 各组大鼠INR值比较

2.4 各组大鼠PT比较 见表4。治疗第3天，与假手术组比较，其他各组PT均明显降低(P<0.05)；模型组、华法林组和三七组PT相比无统计学差异(P>0.05)；治疗第7天，与假手术组比较，其他各组PT均有统计学差异(P<0.05)；华法林组、三七组与模型组PT对比均有统计学差异(P<0.05)，华法林组与三七组PT对比有统计学差异(P<0.05)。

表4 各组大鼠PT比较(s)

2.5 各组大鼠皮下出血情况比较 假手术组、模型组、三七组大鼠在建模期间及治疗期间均未出现皮下出血情况；华法林组在治疗第7天有1只大鼠出现皮下瘀点。

3 讨 论

心房纤颤引起的血栓栓塞事件(卒中、体循环栓塞等)，严重影响国民生存质量、危害国民健康。目前认为心房颤动血栓形成的机制主要有以下方面:血流动力学紊乱、内皮功能异常、血液成分的改变。三者相互作用,共同导致了心房颤动时心房、心耳血栓的形成[14-15]。随着TFPI的发现，20世纪90年代所提出的TFP学说，认为TF凝血途径在血栓形成中发挥重要作用，使得许多凝血方面问题找到合理解释。TF是一种含有糖基的单链跨膜蛋白,由跨膜区和膜外区组成。TF的膜外区即可溶性TF,是血浆中可测得的TF,与血液的凝固性密切相关。TF系活化因子Ⅶ的辅因子,对于凝血过程的启动至关重要。当因子Ⅶa结合到TF后,该复合体就通过级联效应激活因子Ⅸ和因子Ⅹ而发挥作用。而该途径的抑制性调节是通过TFPI来完成的,它通过与TF形成稳定的四联体来阻断凝血进程。有研究发现,TF和TFPI与血栓栓塞性疾病密切相关，无论是心房颤动还是脑卒中患者,其血浆TFPI含量均显著升高,TFPI还是心房颤动预后的独立因子[16],在血栓栓塞性患者中,血浆TF含量减低,而TFPI含量升高[17]。TF被过度激活和/或TFPI活性降低均可引起高凝状态，从而使机体更易形成血栓；相反，则容易引起出血。

中医认为，血液滞留或凝结于体内称为瘀血，包括血溢出于经脉外而瘀积，也包括血脉运行受阻而滞留经脉腔内，既是病理产物，又可成为继发性致病因素。AF时血行不畅，留滞于心腔之内，形成血栓，即为瘀血。因此，及时清除瘀血、疏通脉道，为治疗之首务。从中医“血瘀”理论出发，“血栓形成的瘀血”应以活血化瘀为治疗大法[18]。三七以其畅血脉、散瘀滞、行血不伤新等功效在瘀血治疗中广泛应用。《本草纲目》记载三七可以“止血、散瘀、定痛”;《中国医药大辞典》“三七功用补血，去瘀损，止血衄，能通能补，功效最良，是方药中之最珍贵者”。综上所述，中药三七是活血化瘀的代表药物，活血不伤正气、止血不留瘀。现代医学研究表明，其有效成分三七皂苷、三七素有广泛药理作用及临床用途[19]。舒斌等[20]通过动物实验发现，三七素可以缩短大鼠凝血时间，显著影响大鼠凝血系统而发挥止血作用。金硕果等[21]通过临床试验证实，三七可能通过内源性凝血，降低脑卒中患者抗血小板治疗中皮肤黏膜出血率。周红辉等[22]研究表明，三七皂苷具有保护血管内皮细胞、抗血小板聚集而发挥预防血栓形成、抗凝的作用。三七多组分、多靶点、多层次的治疗特点是其调节促凝与抗凝平衡、且具有双向调节作用的基础。

本研究从平衡TF、TFPI水平方面，研究三七对心房颤动大鼠TF、TFPI表达水平、血凝系列的影响，通过建立房颤大鼠模型，并予以心房颤动大鼠三七治疗，对比华法林治疗，检测血液TF、TFPI表达水平以及血凝系列INR，并观察大鼠皮下出血情况。研究结果显示：相比模型组，三七组可以明显降低房颤大鼠血清TF，而TFPI下降不明显，提示三七可以间接提高TFPI从而抑制高凝状态，预防血栓形成；相比华法林组，三七组可以降低血清TF、TFPI，而华法林组TFPI下降趋势更明显，由此推测三七可以通过间接升高TFPI更强力度调节血清TF，达到TF、TFPI的相对平衡，以减少出血风险；对于血凝指标INR、PT的影响，治疗前3天对比对照组无统计学差异，考虑为三七、华法林起效缓慢，治疗初期由于血浆抗凝蛋白细胞被抑制，可以存在短暂高凝状态；而治疗第7天，三七组和华法林组对于房颤大鼠INR、PT指标均有明显提高，以抑制高凝状态，预防血栓形成，但是华法林对于升高INR趋势更明显，考虑观测时间较短，三七作用还未达到峰值。综上所述,三七能通过平衡心房颤动大鼠血浆中的TF、TFPI水平,抑制高凝状态，减少血栓栓塞并发症和防止出血，从而维持抗凝/出血的稳态。

本实验存在以下不足：①模型方面：尚未观察三七在持续性房颤及永久性房颤中对TF、TFPI及血凝系列变化的影响。②观察周期方面：本实验观测时间较短，三七作用还未达到峰值，下一步可以进行多时间点观测，以进一步明确三七对凝血指标的影响。③三七组分方面：本实验尚未观察三七多组分多靶点发挥效应，下一步可以从三七及其不同组分配伍方面观察TF、TFPI水平对抗凝/出血稳态的影响。④三七剂量分组方面：本实验尚未进行剂量分组实验，下一步可以观察不同剂量三七对房颤大鼠的影响。