二仙汤治疗绝经综合征的网络药理学研究

孙薇丽 ，郝健亨 ，郭彩霞 ，毛宇楠 ，刘宏奇

（1.山西中医药大学，山西晋中030619； 2.山西中医药大学附属医院，山西太原030024）

女性在绝经前后期，女性荷尔蒙随着卵巢功能逐渐退化而减少，会出现一些生理和心理方面的症状，主要表现为潮热、疲倦、四肢酸痛、焦虑、失眠、情绪低落等，临床称为绝经综合征［1］。平均年龄为51 岁，它标志着女性生殖状态的重要转变。中医学将其归于“经断前后诸证”范畴，常见于中医“脏躁”和“百合病”等相关病症。中医认为肾虚是其主要病机，肾气不足导致机体阴阳平衡失调，脏腑功能出现紊乱。激素替代疗法是目前治疗绝经综合征的最常见的方法，但药物不良反应也一直是不能避免的问题［2-3］。近年来中医学在绝经综合征治疗方面逐渐显出优势，中医多以补肾治疗围绝经期综合征，尤其是以补肾阴的配方和治疗方案为主导［4］。二仙汤作为中医有名的方剂，全方由知母、仙茅、淫羊藿、黄柏、巴戟天、当归6味中药组成，仙茅和淫羊藿温补肾阳，巴戟天补益精血，知母和黄柏滋阴清肝，当归温润调血补气，诸药配伍补虚同时去除苦寒之弊，可有效平衡人体阴阳，调和内外，体现了阳中求阴、阴中求阳的精神，对治疗绝经综合征有很好的疗效［5］。在此，我们使用网络药理学的方法来研究二仙汤对绝经综合征的治疗作用，并发现活性成分、靶点以及信号通路间的相互作用与关系。

1 材料与方法

1.1 二仙汤活性成分的筛选和靶点的收集

通过TCMSP 中药系统药理数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）进行检索，收集二仙汤中所包含的6 味中草药的活性成分，设定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）和类药性（Druglikeness，DL）的相关参数（OB≥30%，DL≥0.18）进行筛选，最终确定其主要有效活性成分。同时利用TCMSP 平台查找收集其对应的靶点，并将这些靶点信息通过 Uniprot 网站（http：//www.uniprot.org/）得到目标基因名称，更简洁地表达成分与靶标之间的关系。

1.2 二仙汤活性成分和靶点的网络构建

将收集的二仙汤活性成分和靶点等信息进行整理，并把以上信息导入Cytoscape 3.7.2 软件（http：//cytoscape.org /），分析各药物靶点的相关参数，构建二仙汤活性成分和靶点网络关系图，进行可视化分析。

1.3 绝经综合征的基因检索

利用 OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）、GeneCards 数据库 （https：//www.genecards.org/）和DisGeNET 数据库（http：//www.disgenet.org/），选取“perimenopausal syndrome”或“climacteric syndrome”为关键词进行检索，将3 个数据库中符合疾病的基因汇总，去除其中的重复靶点，最终筛选得到绝经综合征的相关靶点。

1.4 绝经综合征和二仙汤共同靶点基因的PPI网络构建

将得到的绝经综合征和二仙汤交集基因靶点输入到 String 线上数据库（https：//string-db.org/），选择物种为“homo sapiens”，最高置信度设置为0.9，隐藏PPI 网络中游离的靶标基因，导出PPI网络信息文件，再运用Cytoscape 3.7.2 软件将文件转化为PPI 网络图。

1.5 KEGG 通路和GO 富集分析

将最终选出的二仙汤治疗绝经综合征的共有基因靶点，结合R 语言，进行GO 的生物过程（biological process，BP）、 分 子 功 能（molecular function，MF）、细胞组分（cell component，CC）富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。将校正P 值≤0.05 的项目进行筛选，根据富集基因的校正P 值来排序，选取排名在前的相关信号通路，使用R 3.6.3 软件，安装利用相关R 包，绘制柱状图和气泡图。

1.6 二仙汤-成分-绝经综合征-通路-靶点网络图构建

为了更好地理解复方中药、成分与其相应靶点和通路之间的复杂相互作用关系，本文以二仙汤对应的中药成分、成分靶点和富集的通路为依据，利用Cytoscape 3.7.2 软件，构建中药-成分-疾病-通路-靶点网络图。

2 结 果

2.1 二仙汤活性成分筛选和靶点信息收集

基于TCMSP 数据库，最终共筛选出二仙汤中药活性成分104 个，其中当归2 个，仙茅7 个，知母 15 个，淫羊藿 23 个，巴戟天 30 个，黄柏 27 个，去除重复成分还有92 个。通过TCMSP 数据库和Uniprot 信息匹配，最终预测二仙汤有效作用靶点为 224 个。

2.2 二仙汤活性成分和靶点的网络构建

应用Cytoscape 软件构建二仙汤活性成分和靶点网络可视图（图1），分析二仙汤中重要的成分和靶点信息。该网络图由304 个节点和1390 条边组成，红色菱形节点代表靶标基因，玫红色圆形节点代表巴戟天活性成分（左上角），淡蓝色圆形节点代表黄柏活性成分（左下角），淡红色圆形节点代表仙茅活性成分（正上方），淡紫色圆形节点代表知母活性成分（右上角），深绿色圆形节点代表淫羊藿活性成分（右下角），当归活性成分只有两种且与多种药物成分重合，所以无单独颜色显示。图中八边形代表药物交集靶标基因，A1 为知母和淫羊藿交集靶标基因，B1 为知母、当归、仙茅、黄柏交集靶标基因，C1 为当归、巴戟天、仙茅、黄柏交集靶标基因，D1 为淫羊藿和黄柏交集靶标基因。图形大小代表degree 值的大小，degree 值越大图形越大，表示其在网络中的作用越重要。

图1 二仙汤“活性成分-靶点”网络图

2.3 绝经综合征和二仙汤共同靶点基因的收集

将 OMIM、GeneCards 和 DisGeNET 3 个数据库中检索到的疾病相关基因汇总并去重后，共收集到绝经综合征基因4035 个。利用在线Venn 图设计网站（http：//bioinfogp.cnb.Csic.es/tools/venny/）对二仙汤靶点基因和绝经综合征疾病靶点分析制图，最终得到61 个交集基因靶点，见图2。将61个交集基因靶点输入String 数据库，将生成的含有节点信息的TSV 文件通过Cytoscape 软件构建靶点的PPI 网络（图3），包括节点60 个，边线619条（在String 数据库中设置隐藏无关联的节点，有1 个交集靶标基因未参与网络构建）。节点的大小代表自由度（degree），节点越大颜色由浅黄到深红程度越深，代表其在网络中的作用越重要，线条的粗细代表综合得分（Combined scoer），线条越粗颜色越深表示靶点间的相互作用越紧密。

图2 二仙汤基因靶点和绝经综合征基因靶点Venn 图

图3 绝经综合征和二仙汤共同靶点基因的PPI 网络图

2.4 GO 富集分析结果

将绝经综合征和二仙汤共同靶点进行GO 富集分析，引用String 数据库，将校正P 值≤0.05 的项目进行筛选，共富集到1631 条生物过程，62 项分子功能相关，26 项细胞组成相关。使用R 3.6.3软件，安装并引用 clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，绘制得出条形图和气泡图（见图4、图5）。图中气泡越大表示富集到的基因数目越多，颜色越红表示其显著性越明显。GO 分析结果表明，二仙汤-绝经综合征基因参与的生物学过程变化主要包括多细胞生物过程（multi-multicellular organism process）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）、DNA 结合转录因子活性的调节（regulation of DNA-binding transcription factor activity） 和上皮细胞增殖的调节（regulation of epithelial cell proliferation）等；这些靶点与细胞组分的细胞质囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、囊泡腔（vesicle lumen）、线粒体外膜（mitochondrial outer membrane）和膜筏（membrane raft）等关系密切；同时这些靶点主要富集在分子功能的细胞因子活性（cytokine activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）和生长因子结合（growth factor binding）等。

图4 GO 富集分析条形图

图5 GO 富集分析气泡图

2.5 KEGG 信号通路分析结果

将绝经综合征和二仙汤共同靶点进行KEGG通路富集分析，引用String 数据库，将校正P 值≤0.05 的项目进行筛选，总共富集到138 条信号通路。使用R 3.6.3，安装并引用clusterProfiler 包后，绘制得出条形图和气泡图（见图6、图7）。图中气泡越大表示富集到的基因数目越多，颜色越红表示其显著性越明显。KEGG 通路分析结果表明这些靶点主要涉及的信号通路有磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路、白细胞介素 17（IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、叉头转录因子O（FOXO）信号通路和缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路等，同时与恰加斯病（Chagas disease）、疟疾（Malaria）、甲型流感（Influenza A）等疾病基因信号通路密切相关。

图6 KEGG 信号通路分析条形图

图7 KEGG 信号通路分析气泡图

2.6 二仙汤-成分-绝经综合征-通路-靶点网络图的构建及分析

从二仙汤各味中药中筛选出活性成分，借助多个数据库筛选出的这些成分作用于绝经综合征的相关靶点，找出KEGG 分析相关靶点富集所得通路，三者联合，利用Cytoscape 软件构建二仙汤-成分-绝经综合征-通路-靶点网络图（见图8）。网络图中黄色部分为中药成分靶点，蓝色菱形为中药成分，墨绿箭头为通路。二仙汤中的多种活性成分作用于绝经综合征多个靶点，同时影响调控了多条信号通路，从而形成了一个多靶点、多通路、多环节的网络联系。

图8 二仙汤-成分-绝经综合征-通路-靶点网络图

3 讨 论

围绝经期是女性发生的自然生理事件，被世界卫生组织定义为月经永久停止，并且由于卵巢卵泡减少导致卵巢类固醇激素（雌激素和孕酮）水平降低，产生了复杂的荷尔蒙变化［6］，通常发生在50 岁左右。围绝经期女性可能出现潮热和盗汗、失眠、抑郁和骨质疏松等一系列症状，严重影响了这一时期妇女的生活质量和身心健康。西医治疗目前仍以激素为主，有许多副作用不可避免。中医认为在绝经前后体内肾气逐渐下降，肾气不足，阴阳失衡，最终导致肝肾等脏腑功能失调。临床上多见肾阴虚，故治疗方法以滋肾补阴、平衡肾阴阳为主［4，7］。中医根据患者个体差异，通过辨证论治，在围绝经期综合症的临床治疗中发挥了重要作用。二仙汤由6 味中药组成，方中君药为仙茅和淫羊藿，两药温而不燥，可温补肾阳；巴戟天为臣药，有补肾阳益精血之功效；知母、黄柏相佐，以滋肾阴清肝火；当归温润为使，以补气调血。全方中药互补协同，温肾滋阴，泻火除寒，补虚同时除苦寒之弊，最终使机体达到阴阳调和，内外平衡，有效改善了绝经综合征症状［2，8］。

在药理学方面，淫羊藿含有丰富的黄酮类化合物，其中淫羊藿苷具有雌激素特性并可刺激雌激素驱动的细胞，有效预防绝经综合征导致的骨质疏松症［9-10］。仙茅的根茎醇提物也具有类似特性，可以抗骨质疏松和抗氧化活性［11］。知母含有甾体皂苷，具有雌激素活性，还能够增加骨形成［12-13］。黄柏含有小檗碱等生物碱，与巴戟天中含有的蒽醌类化合物类似，它们都可以通过减弱破骨细胞的分化来减少骨吸收［12-15］。当归根部提取物表现出对子宫组织结构的刺激，阴道上皮明显角质化，血清黄体生成激素浓度降低［16］。二仙汤多种成分共同作用通过调节内分泌系统，增加卵巢激素分泌水平，延缓垂体老化，促进子宫收缩，提高骨密度等多方面调节机体多个组织器官，达到治疗绝经综合征的目的。

二仙汤中6 味中药的活性成分经过筛选以及交集靶标基因去重后，最终得到二仙汤有效作用靶点 224 个，包括 B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B 细胞淋巴瘤蛋白 2 相关 X（BAX）、AKT1、TNF 、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）和IL-6 等多个主要靶标，它们不同程度地影响了疾病的发生发展。研究表明，促炎细胞因子广泛参与了大多数与围绝经期相关的疾病。绝经后妇女血清促炎因子水平升高，尤其是IL-6 和TNF-α，同时部分抗炎细胞因子如IL-4、IL-10 的水平也不同程度增加，这些细胞因子通过这种代偿机制对抗促炎性TNF-α产生的影响。围绝经期促炎细胞因子水平升高和血清抗炎细胞因子水平变化可能与雌激素缺乏导致的单核细胞和巨噬细胞功能受损有关［17］。这些细胞因子对围绝经期的重要表现如骨质疏松症、潮热或抑郁综合征的发生和发展有重要影响。Bcl-2 参与凋亡内在途径的起始阶段，在抑制细胞凋亡中具有重要作用，Bax 则是Bcl-2 蛋白家族的促凋亡蛋白，二者共同参与调节细胞凋亡。绝经综合征模型大鼠卵巢中Bcl-2 表达水平显著下降，Bax 表达水平明显升高，Kang Qiang 等［18-19］用二仙汤干预后发现大鼠氧化应激反应和细胞凋亡情况均有改善，并分析其作用机制可能与其调节卵巢中Bcl-2 和Bax 的表达有关。PI3K 是一系列参与细胞功能的激酶，如细胞生长、增殖、分化等。有研究发现，PI3K-AKT 信号可以协调调节卵泡的生长、发育和成熟，用淫羊藿苷治疗可以提高卵巢中AKT、PI3K 和Bcl-2 的表达水平，提高免疫功能，同时改善雌激素水平，促进绝经综合征的治疗［20］。MAPK3 属于丝裂原活化蛋白激酶家族，也称细胞外信号调节激酶（ERK）。有学者分析过氧化氢诱导的成骨细胞凋亡可能是通过ERK 信号通路介导的，雌激素可通过激活ERK 信号通路来抑制骨细胞凋亡［21］，提示 MAPK3 可能通过 ERK/MAPK信号通路参与围绝经期骨质疏松的发病机制。

GO 富集分析结果发现，二仙汤-绝经综合征基因主要涉及活性氧代谢过程、营养代谢过程和上皮细胞增殖的调节等环节，它们通过多种途径参与调节绝经综合征患者的体内外生殖状态的平衡。围绝经期发生骨质疏松症被认为与卵巢激素缺乏有关，是与年龄有关的骨质流失的最常见原因。妇女在围绝经期雌激素水平降低，活性氧水平升高，氧自由基过量导致骨细胞凋亡增加，骨量减少，促进了骨质疏松生成［22］。因此部分抗骨质疏松药物可以通过调节氧化应激反应与雌激素水平来实现其疗效。有学者基于代谢组学方法研究发现，去卵巢大鼠的脂质代谢、能量代谢和氨基酸代谢均发生了变化。去卵巢骨质疏松大鼠血清中的超氧化物岐化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）含量明显降低，血清丙二醛（MDA）含量增加。二仙汤可以通过调节脂质、能量和氨基酸代谢紊乱的途径来逆转骨质疏松症的病理过程，提高SOD和糖化血清白蛋白（GSP）的活性，并降低大鼠血清中MDA 的含量。GO 富集分析结果为研究治疗围绝经期骨质疏松症提供了新的思路［23］。

KEGG 通路富集结果显示TNF 信号通路、PI3K-AKT 信号通路、IL-17 信号通路、FoxO 信号通路和HIF-1 信号通路富集了多数关键基因，可能与二仙汤治疗绝经综合征有重要联系。绝经综合征的根本原因在于卵巢功能下降，而卵巢细胞的增殖和凋亡是影响卵巢功能的重要因素。PI3K-AKT 信号通路对于多种生物学过程至关重要，它参与卵巢颗粒细胞的增殖、分化和迁移。一方面，该途径可以调节细胞增殖和分裂，另一方面，它可以控制细胞凋亡。有研究表明，通过调节PI3K-AKT 途径，淫羊藿苷可以改善围绝经期大鼠的抑郁症状，增加p-AKT 的相对表达，并促进抗凋亡因子Bcl-2 的表达，从而平衡围绝经期抑郁症大鼠的性激素紊乱，调节大脑中神经递质的分泌，增强免疫功能，并改善绝经综合征［20，24］。同时PI3K- AKT 细胞信号通路还通过促进成骨细胞增殖、分化和骨形成而参与骨质疏松的抑制。FoxO1 受PI3K-AKT 途径调控，参与细胞增殖、凋亡、自噬、代谢、炎症反应等病理和生理过程。由于这些广泛的功能，FoxO1 在骨骼肌和心肌、脂肪组织和胰腺β 细胞等绝经综合征相关的各种组织中存在大量基因靶标。Sun Zhihua 等［25-26］研究表明，胰高血糖素样肽1 受体激动剂（GLP-IRA）对卵巢颗粒细胞增殖和抗凋亡的促进作用部分是通过FoxO1 磷酸化位点来介导的。围绝经期妇女的冠状动脉疾病发病率和死亡率均上升到绝经前妇女的5 倍，表明雌激素降低可能促进了冠状动脉疾病的发展。据报道，MAPK1 的下游因子，例如HIF-1和血红素加氧酶1（HO-1），它们作为保护因子参与调控了围绝经期冠状动脉疾病的发展［27］。绝经综合征患者血清多种炎性因子水平异常升高，说明患者体内存在慢性炎症状态。IL-17 信号通路和TNF 信号通路被认为是经典的免疫信号通路，可以激活与绝经综合征发病机理相关细胞内的分子信号。IL-17 细胞因子是Th17 细胞分泌的主要细胞因子，可增加T 细胞的活性并诱导多种促炎介质的产生；TNF-α 则为炎症早期的重要炎症因子，通过激活多种信号途径和分子，调节细胞的分化、增殖和凋亡。陈鹏等［28］研究发现，围绝经期发生的骨质疏松症，其TNF-α 可以通过激活核转录因子（NF-κB）促进核因子κ B 受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞形成，诱导骨质疏松的发生发展。研究表明，二仙汤治疗会减弱血清中TNF-α 的产生，保护成骨细胞免受TNF-α 诱导的细胞凋亡，二仙汤发挥了抗骨质疏松作用与通过AKT/转录因子NF-类胡萝卜素2 相关因子（Nrf2）/HO-1 信号通路减弱成骨细胞凋亡密切相关［29］。最后，我们将通路相关基因信息与二仙汤-成分-绝经综合征PPI 网络相结合，获得了中药-成分-疾病-通路-靶点网络。该网络简洁地表达了药物疾病靶标之间的相互作用以及通路与靶标之间的关系，这些与疾病相关基因或相关的途径可能成为绝经综合征发展的关键途径，这些途径可以调节复杂的生物和代谢过程，而干扰这些途径的某些靶标可能是未来治疗绝经综合征的潜在方法。

网络药理学基于“疾病-基因-药物”的信息，建立“疾病表型生物分子”网络，对中医从经验医学转变为循证医学有重要意义。当前的网络分析是基于已经进行的研究和可获得的文献，有效地理解中医和西医之间密切联系的方法。本研究通过网络药理学方法分析了二仙汤与绝经综合征相关的活性成分、靶点以及信号通路间的相互作用、关系，初步阐释了二仙汤治疗绝经综合征的作用机理，为后期进一步的实验研究以及中西医结合的临床治疗提供了理论基础。