基于网络药理学探讨酸枣仁汤治疗睡眠障碍的作用机制

刘 毅，李 菲，贾跃进，郝世飞

（1.山西中医药大学，山西晋中030619； 2.山西中医药大学附属医院，山西太原030024；3.山西省人民医院，山西 太原030012）

睡眠障碍（Sleep disorder）是一种表现为入睡困难、睡眠维持困难或早醒并伴有日间功能障碍的一种睡眠障碍［1］，在人群中发病率高达 22%~35%［2］。长期失眠会增加罹患认知障碍、心血管疾病、抑郁症、肿瘤等疾病的风险［3-6］，因此存在较大危害。就药物治疗而言，相对于目前西医治疗睡眠障碍的催眠药多存在中枢神经系统抑制及依赖性、成瘾性等问题［7］，中医药治疗疾病则擅于从整体考虑，多成分、多靶点、多途径地发挥作用，兼具安全、有效性，因此有一定优势。

中医称“睡眠障碍”为“不寐”，认为其总病机是“营卫失和，阴阳不交”［8］，情志不遂所致的不寐较为多见，故治疗上多从肝论治。《辨证录·不寐门》载“气郁既久……则肝血必耗，肝血既耗，则木中之血上不能润于心，而则不寐”［9］。可见肝血失养是不寐的重要证型［1］。酸枣仁汤是治疗肝血不足不寐的代表方剂，出自张仲景《金匮要略》，“虚劳虚烦不得眠，酸枣仁汤主之”［10］，临床试验证实其对于睡眠障碍有确切的疗效［11］，现代药理学研究认为其通过多种靶点、通路发挥镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑等作用［12］。网络药理学常用来阐释中药多成分、多靶点的作用机制，筛选中药活性成分，是当下中药研究的热点［13］，但是检索可得睡眠障碍相关研究却较为有限，因此，利用网络药理学探究其作用靶点、通路相关信息，可以在一定程度上提示睡眠障碍的治疗靶点及指导药物作用机制的相关研究。

1 方 法

1.1 酸枣仁汤各药物有效成分搜集与筛选

利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），分别以“酸枣仁”“川芎”“知母”“甘草”“茯苓”为关键词进行检索，获得其化学成分，并将ADME 设置为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）≥-0.30，得出其有效成分。

1.2 有效成分靶点获取

将1.1 中所得有效成分逐一在TCMSP 数据库中匹配靶点，在Uniprot 数据库中（https：//www.uniprot.org/）将物种设置为：智人，并获取相关数据，利用Excel 将靶点匹配基因名。

1.3 睡眠障碍疾病靶点获取

借助 GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/#）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）3 个数据库，以“insomnia disorder”为关键词进行检索，得到睡眠障碍相关疾病靶点，将数据导入 Excel，合并、去重。

1.4 药物-疾病基因交集

应用R 语言将各药物成分靶点基因名的并集与疾病靶点基因名的并集取交集，得出酸枣仁汤中有效成分直接对失眠障碍起作用的靶点，并生成Venn 图。

1.5 疾病-药物-成分-靶点网络构建

将酸枣仁汤各有效成分、靶点以及疾病名、方剂名分别作为节点（node），将其相互作用关系作为边（edge），导入到 Cytoscape 3.7.1 软件，构建疾病-方剂-成分-靶点和疾病-方剂-药物-成分-靶点网络图。

1.6 蛋白相互作用（PPI）网络构建

String 数据库（https：//string-db.org/）可以对全部可公开获得的PPI 信息资源进行收集、评分和整合，并通过计算预测对其补充。将1.4 所得交集靶点导入String 数据库，令物种设置为智人，去掉没有关联的节点，并导出PPI 网络图像和TSV 文件，将TSV 文件导入Cytoscape 3.7.1 软件构建网络，并按照Degree 值筛选核心靶点。

1.7 GO 富集分析以及KEGG 富集分析

将所得交集靶点基因导入Metascape（https：//metascape.org/）分别进行GO 生物过程（Biological Processes，BP）、分子功能 （Molecular Functions，MF）及细胞成分（Cellular Components，CC）富集分析和KEGG 通路富集分析，利用在线作图平台微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）、Image GP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）分别绘制条形图和气泡图，并应用R 语言下载其通路图。

2 结 果

2.1 酸枣仁汤有效成分和对应靶点

通过对TCMSP 进行检索，并限定OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3，获得酸枣仁有效成分7 种，对应靶点43 个；川芎有效成分6 种，对应靶点39个；知母有效成分8 种，对应靶点107 个；甘草有效成分69 种，对应靶点1270 个；茯苓有效成分6种，对应靶点27 个。其中重复成分2 种，为酸枣仁与甘草的共有成分丁子香萜（MOL000211）及川芎与甘草共有成分谷甾醇（MOL000359），其有效成分基本信息如表1 所示。经去重及排除后，酸枣仁汤全方共搜集到有效成分88 种，对应靶点82 个，将其匹配Uniprot 数据库，从而获得基因名。

2.2 睡眠障碍靶点获取结果

在 GeneCards 数据库中检索“insomnia”，得到2281 个靶基因；在OMIM 数据库中检索“insomnia disorder”并选择gene map 选项，得到相关靶点673 个；以“insomnia”为关键词在 TTD 数据库中检索，可得28 个靶点。合并以上数据删除重复值，共计得到失眠障碍相关靶点基因2916 个。

2.3 药物-疾病交集结果

将以上获取的酸枣仁汤的82 个靶点基因与失眠障碍靶点基因应用R 语言取得交集，如图1，得到36 个交集基因，并将其余基因排除，该36 个基因分属78 种有效成分。

图1 酸枣仁汤—睡眠障碍靶基因交集Venn 图

2.4 睡眠障碍-酸枣仁汤-有效成分-靶点网络构建结果

借助Cytoscape 软件，建立疾病-方剂-成分-靶点网络和疾病-方剂-药物-成分-靶点网络，如图2、图 3。其中图 2 共有 116 个节点，534 条连线，连线表示节点之间发生作用，Degree 值大小用节点面积表示，并按照Degree 值分布。可以看出靶点中Degree 值较大者（Degree>12）有 ESR1、AR、GSK3B、PTGS1、MAPK14、ADRB2、ADRA1B、CHRM1、ACHE。图3 有177 个节点，1169 条边，其中有效成分以MOLID 表示。节点面积和排列同样按照Degree 值大小分布，可以看出其中Degree 较大（Degree>22）的有效成分主要有：7-methoxy-2-methyl isoflavone、formononetin、anhydroicaritin、stigmasterol、licochalcone a、shinpterocarpin、2 -［（3R）-8，8 -dimethyl-3，4-dihydro-2H-pyrano［6，5-f］chromen-3-yl］-5-methoxyphenol、vestitol、medicarpin、licoagrocarpin。

图2 疾病-方剂-成分-靶点相互作用网络

图3 疾病-方剂-药物-成分-靶点相互作用网络

2.5 蛋白相互作用（PPI）网络构建结果

将36 个交集靶点基因导入String，得到PPI网络图，如图4。图中节点表示靶蛋白，连线表示蛋白之间的关系，总计共有节点36 个，边172 条，平均节点度为9.56。从数据库导出TSV 文件并导入Cytoscape，然后进行网络分析，选择节点大小和颜色根据Degree 值由小到大、由暗到亮分布；同时边按照Combined score 值大小由细到粗、由暗到亮分布；再选择Degree 值>12 的核心靶蛋白在中心圆形排列，其余靶蛋白在外周圆形排列，如图5，其核心靶点分别为 MAOA、AKT1、ACHE、SLC6A4、VEGFA、CAT、MAOB、HTR3A。

图5 蛋白质相互作用核心靶点网络

2.6 GO 富集分析和KEGG 富集分析结果

将36 个交集靶点基因导入Metascape 分别进行 GO 生物过程、GO 分子功能、GO 细胞成分和KEGG 通路富集分析，其中GO 生物过程得到545条富集结果，GO 分子功能得到61 条富集结果，GO 细胞成分得到39 条富集结果，GO 功能富集分析共计得645 条结果。分别选择其前20 项、前9 项、前7 项具有代表性的富集项，借助在线绘图工具制成条形图，如图6。将GO 分析的三项合并至同一条形图，横轴表示其基因数目，颜色代表不同的项目。GO 生物过程主要涉及循环系统中的血管过程、生长调节、细胞对有机环状化合物的反应、化学突触传递、神经递质水平调节等过程；GO分子功能主要与肾上腺素受体活性、类固醇激素受体活性、单胺跨膜转运蛋白活性、神经递质受体等功能活性相关；GO 细胞成分主要包括突触后膜的组成部分、突触后特定膜的组成部分、神经元投射细胞质等。

图6 GO 富集分析各项条形图

KEGG 通路富集结果得出相关通路61 条，将其中具有代表性的前7 条通路制成富集气泡图，如图7。将通路与交集靶点、酸枣仁汤有效成分三者数据导入Cytoscape，制成以三者为节点，作用关系为边的有效成分-通路-靶点网络图，可以更直观地将三者联系起来，如图8 所示。其具有代表性的7 条通路分别是神经活性配体-受体相互作用、癌症中的蛋白多糖、酪氨酸代谢、脂肪细胞中的脂肪分解调节、FoxO 信号通路、雌激素信号通路、癌症中的Micro RNA。全部通路中靶点计数最多者为神经活性配体-受体相互作用，提示酸枣仁汤治疗睡眠障碍最可能是通过该通路发挥作用，具体如图9 所示。

图7 KEGG 通路富集气泡图

图8 有效成分-通路-靶点网络图

图9 神经活性配体-受体相互作用通路

3 讨 论

近年来，现代医学对睡眠障碍的本质、病因学以及病理生理学的认识有了很大进展，但是仍然缺乏公认的失眠疾病模型［14］。中医学对于睡眠的认识源远流长，《黄帝内经》中对睡眠的形成机制就有记载，“卫气昼日行于阳，夜半则行于阴，阴者主夜，夜者主卧……阳气尽，阴气盛则目瞑，阴气尽而阳气盛，则寤矣”［15］。即睡眠是一个依赖营卫之气推动的节律周期，而这个周期一旦被破坏就会造成失眠。《诸病源候论》云“阴气虚，卫气独行于阳，不入于阴，故不得眠”［16］，说明睡眠障碍的发生主要由于营卫之气运行失常，睡眠节律发生改变所致。而肝脏是与营卫之气运行相关性较大的脏腑，其生理功能主要包括主疏泄和藏血，营卫的正常运行有赖于肝的疏泄功能推动，也受制于肝对血的调控［17］，《素问·五脏生成篇》曰“人卧血归于肝”［15］。

酸枣仁汤常用以治疗肝血不足所致的虚烦不寐，方含酸枣仁、川芎、知母、甘草、茯苓5 味中药，酸枣仁主要功效是补肝养心、安神敛汗，药理学研究证实其有GABA 激动剂作用从而表现抗焦虑、镇静的功能［18］；甘草有补脾益气、调和诸药的功效，有研究报道其有神经保护的作用［5，19］；川芎活血行气、祛风止痛，相关研究显示该药物具有脑保护的作用［20］；知母清热泻火、生津润燥，研究确认其存在神经保护的功效［21］；茯苓可利水渗湿、健脾安神，并存在抗炎、镇静催眠作用［22］。即酸枣仁汤中的药物存在镇静、催眠或神经保护等多种可能有益于治疗睡眠障碍的作用。

本研究得出酸枣仁汤有效成分88 种，相应潜在靶点有82 个，与睡眠障碍交集靶点36 个，核心靶点 8 个，GO 富集结果 645 条，KEGG 通路 61条。值得注意的是，药物-疾病交集靶点有36 个，而却分属78 种成分，因此可以得出各药物成分之间可能通过协同作用多靶点、多通路发挥治疗作用。由图4 得出核心靶点分别为MAOA、AKT1、ACHE、SLC6A4、VEGFA、CAT、MAOB、HTR3A，可认为其为酸枣仁汤治疗睡眠障碍的核心靶点。MAOA 编码一种氧化还原酶，在中枢神经系统和周围组织神经活性代谢中起到重要作用［16］，研究显示MAOA 启动子等位基因活性较低的个体可能会出现抑郁症状和睡眠不足的风险增加［23］。Kalonia H 等［24］研究得出氧化损伤与睡眠剥夺后的记忆缺陷有关，MAOB 和 MAOA 功能基本一致［25］。AKT1 编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可控制成人神经发生过程中新生神经元整合过程的速度，包括正确的神经元定位、树突发育和突触形成［26］。乙酰胆碱酯酶（Ache）通过释放到突触间隙快速水解乙酰胆碱，以终止神经肌肉接头处的信号转导并在神经元凋亡中发挥作用［27］，研究证实人类应用乙酰胆碱酯酶抑制剂可明显减少REM 睡眠潜伏期并增加 REM 睡眠密度［28］。SLC6A4 在中枢神经系统的功能主要是5-羟色胺（5-HT）信号传导的调节［29］，HTR3A 基因编码 5-HT 3 型受体的亚基 A，5-HT 有神经递质、激素和促分裂原等作用［30］。Teegarden BR 等［31］研究认为血清素通过 5-HT 受体在调节睡眠结构中起着积极的作用；Pandhare A等［32］研究显示抗抑郁药安非他酮对5-羟色胺3A 型受体具有变构阻滞作用，并可能通过此过程发挥药效。由以上可以看出，酸枣仁汤的核心靶点几乎都作用于神经系统，并且都直接或间接对睡眠有影响。

GO 富集结果显示酸枣仁汤主要的生物过程为：循环系统中的血管过程、化学突触传递、神经递质水平调节等，其中循环系统中的血管过程可从现代医学的角度在一定程度上阐释酸枣仁汤治疗肝血不足的机理，文献研究表明酸枣仁汤对睡眠和血液系统存在协同影响［33］。其他的GO 富集结果与睡眠障碍的神经递质机制吻合，故不赘述。KEGG 通路富集显示通路中靶基因占比最高者为神经活性配体-受体相互作用，目前认为调节睡眠觉醒的分子因素主要包括促觉醒化学物质，如食欲素、去甲肾上腺素、组胺以及促睡眠化学物质，如γ-氨基丁酸（GABA）、腺苷、褪黑激素和前列腺素D2 都是通过该通路发挥作用［34］。另外需要提到的是雌激素信号通路，流行病学显示，睡眠障碍在女性中更普遍而且更年期女性有较高的发病率［35-36］。研究证实雌激素和孕酮可影响女性睡眠方式，且与特定时期的睡眠障碍和嗜睡症相关［37］。同时ESR1 是有效成分-通路-靶点相互作用网络中重要的靶点。综合来看网络药理学结论基本符合现代药理学与临床研究结果。

综上所述，从对酸枣仁汤有效成分、相关靶点、通路的相互关系研究得出酸枣仁汤治疗睡眠障碍可能主要通过调节神经受体-配体相互作用、循环系统相关反应、机体营养代谢以及雌激素相关作用来发挥作用。网络药理学局限于理论研究，但可为后续进一步研究提供思路。