柴胡皂苷a通过影响PPARα信号通路对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脂肪变的保护作用*

顾雪香，李祥玉，单勤星

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除酒精、药物、免疫损伤、病毒感染等明确损肝因素以外，发生超过5%肝细胞脂肪变性引起的疾病。研究发现[1，2]，胰岛素抵抗(IR)在NAFLD发病中具有重要的作用，不仅可阻碍胰岛素对脂肪的代谢，增加机体脂肪量，而且会导致高胰岛素血症，使血液游离脂肪酸(FFA)增多，脂蛋白合成减少，堆积于肝脏。因此，积极改善IR为治疗NAFLD提供了新的思路。柴胡是祖国医学常用的中药，其中药方剂除作为护肝药物广泛应用于急性肝损伤和肝纤维化等的治疗外，近年来也作为改善IR药物逐渐应用于治疗糖尿病患者[3-5]。柴胡皂苷a(saikosaponin a，SSa)是柴胡的主要有效成分，其抗病毒、抗炎、抗肿瘤等药理作用已被广为认可，但关于其改善IR作用及其应用于治疗NAFLD效果的研究尚少。本研究通过建立NAFLD大鼠模型，并给予SSa干预，观察了对脂肪变的干预效果，并探讨了其可能的作用机制，为SSa应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、药品、试剂 46只SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量为190～210 g，由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供[动物许可证号为SCXK(沪)2018-0006]。URIT-8020A全自动生化分析仪(桂林优利特电子集团有限公司)、Synergy-HD显微镜(日本Toshiba公司)、Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳仪(美国伯乐公司)。SSa(纯度>98%，上海博麦德生物技术有限公司)、抗过氧化物增殖物活化受体α(PPARα)信号通路抑制剂GW6471(美国R&D Systems公司)、高脂饲料(江苏省协同医药生物工程有限公司)、血糖测定试剂盒、放射免疫分析测定胰岛素试剂盒(北京北方生物技术研究所有限公司)，检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，油红O染色试剂盒(上海懋康生物科技有限公司)，兔抗大鼠5-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase， AMPK)、抗p-AMPK、抗过氧化物增殖物活化受体α(peroxide proliferator activated receptor α，PPARα，美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 NAFLD模型建立[6]随机将46只大鼠分为对照组10只和NAFLD组12只、SSa干预组12只和SSa联合GW6471干预组12只。给予对照组动物普通饲料喂养，给予其他组动物高脂饲料(普通饲料73%、猪油20%、白糖4%、奶粉2%、胆固醇1%)喂养8 w。在干预组，每组取2只动物检查造模情况。在建模成功后，分别给予SSa 5 mg.kg-1(溶于生理盐水)灌胃，或SSa灌胃和GW6471 3.5 mg.kg-1腹腔注射，或给予等体积生理盐水灌胃和腹腔注射，1次/d，连续干预14 d。在末次给药后禁食不禁水24 h，称体质量。给予戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血5 mL。采用脱颈法处死大鼠，冰盘上分离肝脏，称质量，计算肝指数(%)=肝脏质量/体质量×100%；将其余肝组织置于液氮中保存。

1.3 血糖指标检测 采用葡萄糖氧化酶偶联比色法和放射免疫分析法检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.4 肝组织脂肪含量检测 取出液氮保存的肝组织，按照肝组织质量：生理盐水=1:9匀浆，4 ℃摇床过夜，离心10 min，收集上清，使用全自动生化分析仪检测TC、TG和FFA含量。

1.5 肝组织病理学检查 取肝组织，低温速冻后，切成7 μm厚的切片，常温风干0.5 h，4%多聚甲醛固定10 min，蒸馏水充分冲洗。在60%异丙醇中浸泡180 s。导入油红O储液60 mL、蒸馏水40 mL 30min。加60%异丙醇，蒸馏水充分冲洗，苏木精对比染色120 s，蒸馏水充分冲洗，用水性封片机固封，常温阴干后在显微镜下观察。

1.6 肝组织AMPK、p-AMPK和PPARα蛋白表达检测 采用Western blotting法检测，取液氮保存的肝组织，研磨后转至离心管，加入RIPA裂解液裂解30 min，用BCA试剂盒定量。取60 μg样品，按比例与上样缓冲液混合，100 ℃金属浴煮5 min，使蛋白变性，在8%凝胶上电泳分离蛋白质，湿转至膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗大鼠AMPK(1:400)、抗p-AMPK(1:400)、抗PPARα(1:500)、抗GAPDH，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤，加入山羊抗兔IgG(1:2 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤，加入ELC显影剂于暗室曝光、显影，在凝胶成像系统扫描分析，以AMPK、p-AMPK、PPARα灰度值/内参GAPDH灰度值表示蛋白相对表达量，计算p-AMPK/AMPK比值。

2 结果

2.1 各组血糖指标比较 与对照组比，NAFLD组FBG、FINS和HOMA-IR显著升高(P<0.05)；与NAFLD组比，SSa干预组FBG、FINS和HOMA-IR显著降低(P<0.05)；与SSa干预组比，SSa联合GW6471干预组FBG、FINS和HOMA-IR显著升高(P<0.05，表1)。

表1 各组血糖指标比较

2.2 大鼠肝指数和肝组织脂质含量比较 与对照组比，NAFLD组肝指数和肝组织TC、TG、FFA含量显著升高(P<0.05)；与NAFLD组比，SSa组肝指数和肝组织TC、TG、FFA含量显著降低(P<0.05)；与SSa组比，SSa联合GW6471组肝指数和肝组织TC、TG、FFA含量显著升高(P<0.05，表2)。

表2 各组肝指数和肝组织脂质含量比较

2.3 各组肝组织病理学表现比较 NAFLD组可观察到橘红色脂滴呈弥漫性分布和大泡性脂肪变，而在SSa干预组和SSa联合GW6471干预组肝组织脂滴显著减少，其中SSa组脂滴少于SSa联合GW6471组(图1)。

图1 各组大鼠肝组织脂质沉积表现(油红O染色， 200×)A：对照组；B：NAFLD组；C：SSa组；D：SSa联合GW6471组

2.4 各组肝组织PPARα蛋白相对表达量比较 与对照组比，NAFLD组PPARα蛋白相对表达量和p-AMPK/AMPK比值显著降低(P<0.05)；与NAFLD组比，SSa干预组PPARα蛋白相对表达量和p-AMPK/AMPK比值显著升高(P<0.05)；与SSa干预组比，SSa联合GW6471干预组PPARα蛋白相对表达量和p-AMPK/AMPK比值显著降低(P<0.05，表3)。

表3 各组肝组织蛋白相对表达量比较

3 讨论

本研究结果显示，采用SSa干预NAFLD大鼠后，其FBG、FINS、HOMA-IR、肝指数，肝脏组织TC、TG、FFA含量均显著降低，肝组织脂滴减少，提示SSa可有效改善NAFLD大鼠IR，并减少肝组织脂质沉积。SSa是柴胡提取物中活性最强的成分之一，有抗内毒素、调节免疫系统功能、抗炎、抗肿瘤、保肝、护肾等广泛的药理作用，但目前关于其调节糖脂代谢作用的研究尚少。有学者在治疗血糖不能控制的2型糖尿病时发现[7-9]，柴胡桂枝干姜汤方可有效控制血糖，促进胰岛素分泌并抑制IR，在此方中柴胡可能发挥了功效。此外，现代药理学研究表明[10-12]，SSa可调节肝细胞能量代谢异常、维持钙平衡、抑制脂质和氧自由基过氧化、调节肝细胞免疫功能，阻滞纤维化进程，从而发挥肝细胞保护作用，说明其具有调节糖脂代谢平衡的生物学功能。

PPARα属于新型甾体类激素受体，通常表达于肌肉组织和进行FFA氧化的器官。研究发现[13-16]，PPARα激活后可促进肝组织FFA发生β氧化，调控脂质代谢基因表达，提高脂质利用效率，减少FFA合成和在肝脏的沉积。AMPK通过感受胞浆AMP与ATP的比值变化调节细胞物质代谢，调控骨骼肌对葡萄糖的摄取、FFA氧化和ATP生成，以维持细胞能量的平衡[17-19]。研究表明[20]，抑制AMPK磷酸化，PPARα表达明显下调，能加快NAFLD进程，而激活AMPK则具有胰岛素增敏效应，促进脂肪酸氧化代谢。由此可推测，AMPK-PPARα信号通路可能是治疗NAFLD的新靶点。